兩棲類壺菌病3種PCR鑒定方法與比較

李斌，黃艷，王宇，邵晨(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，浙江金華321004)

蛙壺菌(Batrachochytrium dendrobatidis)是壺菌門(Chytridiomycota)、壺 菌 綱 (Chytridiomycetes)、壺 菌 目(Chytridiales)的一個(gè)新屬(Batrachochytrium)，且蛙壺菌是該屬的唯一物種［1］。蛙壺菌可在4～25℃的溫度下生長，最適溫度17～25℃，它們可以在寄主身上過冬。但蛙壺菌對(duì)熱較敏感，在25℃以上的環(huán)境中生長較差，若高于28℃，生長就會(huì)停止，且在37℃加熱4 h或47℃加熱30 min或60℃加熱5 min致死率將達(dá)到100%［2］。蛙壺菌具有快速的傳染性和廣泛的暴發(fā)性，但同時(shí)其傳染性和暴發(fā)性具有明顯的季節(jié)性和地域性。壺菌病在冬季暴發(fā)率較高，且多發(fā)生在高海拔地區(qū)和某些熱帶雨林山區(qū)［3］。蛙壺菌主要寄生于無尾兩棲類成體皮膚和蝌蚪口器中，通過寄主生活的水體進(jìn)行傳播，患病的蛙和蝌蚪攜帶的蛙壺菌游動(dòng)孢子會(huì)隨表皮角質(zhì)層脫落而被釋放到水中，健康蛙和蝌蚪則會(huì)因接觸含蛙壺菌游動(dòng)孢子的水而感染壺菌?。?］。蛙壺菌主要通過影響蛙體皮膚的功能來影響其機(jī)體的生理機(jī)能，皮膚對(duì)兩棲動(dòng)物保持物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和電解質(zhì)平衡具有重要作用，個(gè)體感染蛙壺菌后，依賴皮膚的電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制率達(dá)50%以上，血漿鈉、鉀濃度分別減少了20%和50%，嚴(yán)重影響了心肌功能，從而導(dǎo)致心跳驟停而死亡［5］。

壺菌病廣泛性暴發(fā)是導(dǎo)致全球兩棲類種群數(shù)量急劇下降的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)此病自1978年已經(jīng)遍布整個(gè)澳洲，目前非洲、南美洲、北美洲、歐洲和亞洲均發(fā)現(xiàn)兩棲動(dòng)物感染蛙壺菌［1，6－16］。自2010年國內(nèi)首次報(bào)道在云南的滇蛙(Rana pleuraden)、牛蛙(Rana catesbeiana)、云南臭蛙(Odorrana andersonii)、昭覺林蛙(Rana chaochiaoensis)中發(fā)現(xiàn)蛙壺菌感染以來，四川、湖北、貴州、湖南、浙江、北京、天津、河北的石家莊以及河南的鄭州在野外均發(fā)現(xiàn)蛙壺菌的分布［15－16］。同時(shí)，研究表明在20世紀(jì)八九十年代的國內(nèi)館藏標(biāo)本中也檢測(cè)到蛙壺菌的DNA分子［17－18］。說明我國兩棲類蛙壺菌的感染可能要追溯到20世紀(jì)八九十年代，甚至更早。目前，壺菌病檢測(cè)主要依賴組織學(xué)、免疫組織化學(xué)以及PCR等方法，但組織學(xué)和免疫組織化學(xué)法對(duì)壺菌病感染早期不敏感，且對(duì)蛙體的正常生存具有一定影響。用常規(guī)PCR或改進(jìn)的巢式PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，靈敏性和特異性相對(duì)較高，有助于在飼養(yǎng)和野生的兩棲動(dòng)物種群中及早發(fā)現(xiàn)蛙壺菌［19－20］。筆者對(duì)常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)定量PCR在蛙壺菌檢測(cè)中的應(yīng)用分別進(jìn)行概述，并對(duì)這3種PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析與比較，為兩棲類壺菌病檢測(cè)方法的選擇提供參考。

1 蛙壺菌的PCR檢測(cè)方法

1.1 常規(guī) PCR PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的方法。1985年，美國Mullis等［21］學(xué)者首創(chuàng)了PCR技術(shù)，并由美國PE-Cetus公司開發(fā)研制。PCR反應(yīng)中，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，通過雙鏈DNA的高溫變性(denaturation)、低溫退火(annealing)和適溫延伸(extension)3步實(shí)現(xiàn)一個(gè)循環(huán)，在不斷循環(huán)中，每一循環(huán)所合成的新DNA鏈，又作為下一循環(huán)中的模板，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加，一般單一拷貝的DNA片段擴(kuò)增循環(huán)25～30次，可擴(kuò)增l00萬～200萬倍［22］。自PCR技術(shù)問世以來，已在微生物檢測(cè)、臨床診斷、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如姜莉莉等［23］選擇外毒素A基因(PEA)作為 PCR檢測(cè)的目標(biāo)基因，建立了水貂綠膿桿菌PCR快速檢測(cè)方法;張立軍等［24］通過PCR技術(shù)鑒定擬南芥T-DNA插入突變體atsuc3等。

Annis等［19］在利用常規(guī)PCR對(duì)蛙壺菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，根據(jù)蛙壺菌位于5.8 S rDNA的特異性DNA片段設(shè)計(jì)引物，通過設(shè)計(jì)的引物Bd1a(5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3')和Bd2a(5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的片段［19］，回收和純化目的片段，再將得到的目的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進(jìn)行序列分析。

1.2 巢式PCR 巢式PCR(Nested PCR)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA擴(kuò)增技術(shù)，具有較高的特異性和靈敏度，巢式PCR甚至可以在污染或已經(jīng)降解的樣本中進(jìn)行DNA擴(kuò)增［25］。其高特異性和靈敏度使得它在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究方面都有廣泛應(yīng)用［26－28］。巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA片斷。第一輪擴(kuò)增中，外引物用以擴(kuò)增得到特異性的DNA片段，作為第二輪擴(kuò)增的模板，第二對(duì)引物特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷，得到擴(kuò)增的目的片段［29］。兩輪PCR反應(yīng)增加了目的基因的數(shù)量，從而提高了檢測(cè)靈敏度［30］。

2005年Garner等［9］采用巢式PCR對(duì)歐洲壺菌病進(jìn)行研究，結(jié)果表明蛙壺菌在歐洲具有廣泛而不規(guī)則的分布。2009年Gaertner等［31］利用巢式PCR對(duì)美國德州5種地方性蠑螈的壺菌病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)5種蠑螈都存在一定程度的蛙壺菌感染，同年，Goka等［32］同樣使用巢式PCR對(duì)日本壺菌病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在部分兩棲動(dòng)物中也存在壺菌病，另外，2012年Bai等［16］使用巢式PCR對(duì)我國壺菌病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)云南、貴州、浙江等10省中均有蛙壺菌分布。在使用巢式PCR檢測(cè)蛙壺菌中，蛙壺菌的一段特異性DNA片段是位于ITS4和ITS5(ITS:轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))之間的一段DNA序列(圖1)，試驗(yàn)中可以使用真菌通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一段特異性的DNA片段［33］。以得到的DNA片段作為模板，使用蛙壺菌特異性引物Bd1a(5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3')和Bd2a(5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增［19］，后續(xù)步驟與常規(guī)PCR類似，將得到的目的片段依次進(jìn)行回收、純化、轉(zhuǎn)化、克隆和測(cè)序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進(jìn)行序列分析。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time TaqMan PCR)是由美國Applied Biosystems公司于1996年研發(fā)的一種新型實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸技術(shù)，該技術(shù)將核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和光譜技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實(shí)現(xiàn)其實(shí)時(shí)定量功能［34－35］。

2006年Garner等［36］對(duì)北美洲的加拿大、美國等8個(gè)國家的牛蛙(Rana catesbeiana)壺菌病研究中發(fā)現(xiàn)7個(gè)國家的牛蛙中都檢測(cè)到蛙壺菌感染。同年，Kriger等［37］對(duì)野外101只巨型斑蟾(Mixophyes iteratus)使用實(shí)時(shí)定量PCR和組織學(xué)方法對(duì)蛙壺菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明實(shí)時(shí)定量PCR的靈敏度明顯高于組織學(xué)檢測(cè)方法。2010年Bai等［15］在我國云南5種兩棲動(dòng)物中的4個(gè)物種中檢測(cè)到壺菌病。Bataille等［13］對(duì)韓國壺菌病分布情況研究中發(fā)現(xiàn)壺菌病已在韓國廣泛傳播。以上幾項(xiàng)調(diào)查研究中均使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，在使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)蛙壺菌時(shí)，引物和探針一般采用通用壺菌檢測(cè)引物和探針:

引物:ITS1-3 Chytr:5'-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3';5.8SChytr:5'-AGCCAAGAGATCCGTTGTCAAA-3';探針:ChytrMGB:5'-6FAM CGAGTCGAACAAAAT MGBNFQ-3'。

在反應(yīng)條件上實(shí)時(shí)定量PCR與常規(guī)PCR和巢式PCR有所不同:50℃ 2 min，95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，50個(gè)循環(huán)［20］。將得到的目的片段依次進(jìn)行回收、純化、轉(zhuǎn)化、克隆和測(cè)序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進(jìn)行序列分析。

2 3種PCR鑒定方法的分析與比較

2.1 巢式PCR與常規(guī)PCR比較 常規(guī)PCR中使用Bd1a和Bd2a作為引物擴(kuò)增出來的DNA條帶約為300 bp［19］。在巢式PCR中，第一步以ITS4和ITS5為引物擴(kuò)增出的條帶約600bp，第二步PCR以Bd1a和Bd2a為引物擴(kuò)增出目的片段［19］。由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大的可能性，保證了反應(yīng)的特異性;同時(shí)，第一步PCR的產(chǎn)物作為第二步PCR的模板，克服常規(guī)PCR“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大地提高了PCR的靈敏度;另外，內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二步PCR反應(yīng)能否順利進(jìn)行，是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，以增加了整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性［29］。但經(jīng)過2次PCR反應(yīng)，在增加反應(yīng)的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性和可行性的同時(shí)也增加了兩步反應(yīng)之間試驗(yàn)污染的概率。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR與常規(guī)PCR比較 實(shí)時(shí)定量PCR中通過引物(ITS1-3 Chytr和5.8S Chytr)和探針(ChytrMGB)與模板的特異性雜交來鑒別模板，相對(duì)于常規(guī)PCR而言，具有較高的準(zhǔn)確性、特異性和較低的假陽性等優(yōu)點(diǎn)［37］;在實(shí)時(shí)定量PCR中將計(jì)算機(jī)和探針技術(shù)相結(jié)合，對(duì)試驗(yàn)中每個(gè)循環(huán)都可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測(cè)的飛躍，提高了試驗(yàn)的精確性，自動(dòng)化程度較高，易于進(jìn)行電腦化數(shù)據(jù)管理［38］。

2.3 巢式PCR與實(shí)時(shí)定量PCR比較 巢式PCR和實(shí)時(shí)定量PCR都有各自的利弊，它們都具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步比較兩者，巢式PCR經(jīng)歷兩步PCR反應(yīng)會(huì)增加試驗(yàn)中污染的概率，而實(shí)時(shí)定量PCR則是在一個(gè)封閉的環(huán)境中完成PCR過程，減少試驗(yàn)中污染的可能性;而且，實(shí)時(shí)定量PCR還具有快速、自動(dòng)化程度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)［38］。另一方面，巢式PCR也有其優(yōu)越性:首先，巢式PCR在蛙壺菌檢測(cè)中具有比實(shí)時(shí)定量PCR更高的靈敏度;其次，若蛙壺菌DNA中具有相對(duì)保守性的ITS區(qū)中出現(xiàn)替換或缺失等突變時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR中的探針可能會(huì)出現(xiàn)與模板雜交失敗的情況，影響PCR的效果，巢式PCR則可以避免此類問題的出現(xiàn)［32］。Goka等［32］使用3種PCR方法對(duì)26種四大類不同基因型的蛙壺菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明靈敏度由高到低依次為巢式PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、常規(guī)PCR，另外，當(dāng)蛙壺菌在ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)域有替換或缺失時(shí)，只有巢式PCR的結(jié)果為陽性。

3 展望

兩棲動(dòng)物種群全球性衰退是21世紀(jì)最緊迫的環(huán)境問題之一，全球2/3的兩棲動(dòng)物種群面臨生存危機(jī)［39］。高致死性真菌病原體蛙壺菌是引起兩棲類種群數(shù)量急劇下降的主要原因之一，其驚人的傳播速度及廣泛暴發(fā)對(duì)世界范圍內(nèi)的兩棲動(dòng)物種群數(shù)量構(gòu)成重大威脅。蛙壺菌己在世界各地發(fā)現(xiàn)并流行，我國具有豐富的兩棲動(dòng)物資源和適合蛙壺菌生存的廣闊的地理環(huán)境，由于蛙類貿(mào)易的發(fā)展，壺菌病已在我國傳播蔓延。為了阻止壺菌病在我國進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延與惡化，必須加強(qiáng)立法，在蛙類貿(mào)易進(jìn)出口建立有效可靠的檢疫防御措施。因此，得到快速、靈敏、簡單、準(zhǔn)確的蛙壺菌檢測(cè)方法迫在眉睫。

另一方面，生物芯片(Biochip，又稱DNA芯片、基因芯片)技術(shù)日新月異，利用生物芯片技術(shù)在對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片或完整的活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有大規(guī)模高通量、靈敏準(zhǔn)確、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)［40－42］。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析［43－45］、DNA 序列測(cè)定［46－47］、新基因發(fā)現(xiàn)［48－49］、醫(yī)學(xué)診療［50－51］等方面。若能將生物芯片技術(shù)運(yùn)用到蛙壺菌的檢測(cè)上，不僅可以快速方便準(zhǔn)確地檢測(cè)蛙壺菌的存在，而且可以同時(shí)檢測(cè)到不同種類的蛙壺菌，甚至明確不同蛙壺菌的基因型及菌株系。

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