花生組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

張鐃丹，何龍飛(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530005)

花生(Arachis hypogaea L.)是全球，特別熱帶、亞熱帶地區(qū)最重要的油料作物與經(jīng)濟(jì)作物之一，種植廣泛。然而，花生栽培普遍存在產(chǎn)量低、病蟲害危害嚴(yán)重、品質(zhì)適用性窄等問題。通過品種改良是解決這些問題的重要途徑。但可利用基因資源的匱乏、優(yōu)良抗性基因源與不良性狀緊密連鎖以及種間雜交不親和性等因素極大地限制了花生傳統(tǒng)育種的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)，加快花生育種進(jìn)程越來越受到重視?；ㄉ蚬こ逃N的關(guān)鍵是建立高效的再生體系，為轉(zhuǎn)基因提供充足的受體材料，而通過遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)新大量種質(zhì)資源，是進(jìn)行系統(tǒng)選育的前提。

1 花生組織培養(yǎng)

花生組織培養(yǎng)對(duì)花生的品種改良、新品種繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)保存和抗性突變體的篩選等具有重要意義。自20世紀(jì)50年代末期Steward培養(yǎng)花生韌皮組織開始，花生組織培養(yǎng)至今已有50多年的歷史，近十幾年來有關(guān)花生再生植株的研究逐漸增多。以花生植物莖尖、未成熟的合子胚、未成熟的葉片、子葉為外植體，進(jìn)行離體培養(yǎng)并獲得再生植株［1］(表1)。

苗利娟等［2］從22個(gè)花生品種中篩選出4個(gè)叢生芽高誘導(dǎo)率的花生品種，并指出花生種子在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率比在MS培養(yǎng)基上稍高;添加500 mg/L羧芐青霉素(Carbenicillin)對(duì)花生幼葉叢生芽分化無抑制作用，叢生芽誘導(dǎo)率可提高13.5個(gè)百分點(diǎn);頭孢霉素(Cefalexin)對(duì)芽誘導(dǎo)具有抑制作用，叢生芽誘導(dǎo)率下降48.5個(gè)百分點(diǎn)。黃玲等［3］研究指出，幼葉外植體分化不定芽頻率明顯高于子葉、上胚軸和下胚軸;6 d葉齡的葉片中間切段為最佳;不同基因型不定芽分化率存在明顯差異。

隋炯明等［4］以不同類型18個(gè)花生品種成熟種子的胚小葉為外植體，對(duì)不定芽誘導(dǎo)及植株再生的研究表明，所有供試品種芽點(diǎn)誘導(dǎo)率均高于60%，但五大類型間及品種間存在顯著差異，龍生型平均誘導(dǎo)率最高，其次是珍珠豆型，多粒型最低。植株再生率差異顯著，最高的是珍珠豆型，最低是多粒型。馬彩霞等［5］以14份不同花生品種的胚小葉為外植體，篩選出最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、伸長培養(yǎng)基和高效再生基因型。不同品種再生率在25.51% ～93.01%，每個(gè)叢生芽伸長數(shù)達(dá)到7.24，時(shí)間縮短至21～28 d;并利用“弗落蔓生”在15 d內(nèi)得到了生根組培苗。尤淑麗［6］選用外引及自選共8個(gè)花生品種胚小葉作為外植體，研究愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率，結(jié)果表明，品種間愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率均差異顯著。徐娟等［7］對(duì)4個(gè)花生品種上胚軸及胚小葉的不定芽誘導(dǎo)及其成苗、生根試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同基因型花生品種的再生能力差異顯著，其中湘花2008和中花8號(hào)的不定芽誘導(dǎo)率、成苗率和生根率均較高。

趙明霞等［8］指出，平陽霉素(PYM，Pingyangmycin)對(duì)體胚發(fā)生有顯著的抑制作用，隨著平陽霉素濃度的增大，體胚誘導(dǎo)率顯著下降。2個(gè)供試品種花育20號(hào)和花育22號(hào)的抑制濃度不同，綜合褐化率和體胚形成率，適宜的PYM離體誘變濃度分別為3～4 mg/L和4～5 mg/L，誘變培養(yǎng)時(shí)間為30 d。王莉莉等［9］在快中子輻照對(duì)花生胚小葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響研究發(fā)現(xiàn)，快中子輻照對(duì)誘導(dǎo)花生基因突變是有效的，推斷14.0 Gy為適宜的誘變劑量。

劉艷芝等［10］以花生優(yōu)良品種四粒紅成熟種子胚軸為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生率達(dá)到66.67%;體細(xì)胞胚在6-BA濃度逐漸降低的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)育成完整植株。蔣菁等［11］以花生品種“桂花30”和“桂花771”的胚小葉、下胚軸、子葉節(jié)為外植體，發(fā)現(xiàn)2，4-D的適宜濃度為10 mg/L，經(jīng)過約30 d培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量體細(xì)胞胚，平均誘導(dǎo)率分別為55.37%和36.72%，平均每個(gè)外植體產(chǎn)胚量分別為5.68個(gè)和4.27個(gè)。將誘導(dǎo)形成的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到6-BA濃度逐漸降低的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，體細(xì)胞胚萌發(fā)再生成無根小苗，正常植株再生率分別為32.6%和23.5%。將無根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中可獲得完整植株。戴梓茹等［12］研究表明，不同激素種類對(duì)花生根愈傷組織誘導(dǎo)率的影響程度為6-BA＞KT＞2，4-D。

表1 不同條件對(duì)花生再生體系的影響

噻重氮苯基脲(Thidiazuron，TDZ)是一種新型高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，它能直接或間接誘導(dǎo)外植體從愈傷組織形成到體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一系列過程，具有生長素和細(xì)胞分裂素雙重作用的特殊功能［13－14］。研究發(fā)現(xiàn)，TDZ誘導(dǎo)的芽在伸長和生根上存在困難［15］。張?jiān)骆玫龋?6］研究TDZ對(duì)不同基因型花生子葉節(jié)誘導(dǎo)叢生芽與擴(kuò)繁中的作用，結(jié)果表明，叢生芽經(jīng)擴(kuò)繁后，雖能夠不斷新生叢生芽，但這些叢生芽的伸長和生根也存在困難，TDZ濃度越高，處理時(shí)間越長，叢生芽的再生越困難，這可能是由于TDZ長期的作用導(dǎo)致其再生能力下降。研究還發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)階段用TDZ處理而誘導(dǎo)和擴(kuò)繁階段不添加TDZ時(shí)，產(chǎn)生的叢生芽較易伸長和生根，因此可考慮將擴(kuò)繁的叢生芽經(jīng)過一段時(shí)間不添加任何激素的恢復(fù)培養(yǎng)，再在含6-BA的伸長培養(yǎng)基上再生，以消除TDZ的抑制作用。

2 花生遺傳轉(zhuǎn)化

自1994年Eapen等［17］首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因整合到花生基因組以來，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道了采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法和花粉管通道法等技術(shù)進(jìn)行花生遺傳轉(zhuǎn)化的研究。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑主要是利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生胚狀體、胚小葉、幼葉、子葉、胚軸、胚根等外植體，通過抗生素或除草劑抗性篩選獲得再生植株。相對(duì)于其他途徑，該方法具有操作簡便、不需昂貴設(shè)備、外源基因單拷貝或低拷貝整合、轉(zhuǎn)化頻率較高、遺傳表達(dá)穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn);且在眾多轉(zhuǎn)基因植物中80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的，因而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化已成為研究者進(jìn)行花生基因轉(zhuǎn)化的首選方法。

FAD2基因編碼的Δ12脂肪酸脫氫酶是植物產(chǎn)生多聚不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，石新國等［18］構(gòu)建了帶有FAD2基因反義RNA干擾體和γ-TMT基因的種子特異表達(dá)單元的雙價(jià)種子特異表達(dá)載體pCAMBIA1300AT，并通過農(nóng)桿菌C58介導(dǎo)轉(zhuǎn)化花生品種閩花6號(hào)，共得到21棵再生植株，PCR檢測結(jié)果表明，其中有3株為陽性苗，表明該完整表達(dá)單元的片段已整合到花生基因組中。殷冬梅等［19］在培育高油酸的花生新種質(zhì)的研究中，以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)將含有油酸脫氫酶基因的植物雙元表達(dá)載體pFGC/2nd轉(zhuǎn)入花生，發(fā)現(xiàn)RNA干擾對(duì)內(nèi)源的油酸脫氫酶基因產(chǎn)生了抑制作用。潘麗娟等［20］將控制花生蛋白質(zhì)/油脂含量比例的關(guān)鍵酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S雙元表達(dá)載體，構(gòu)建了帶PEPC反義基因的雙元載體并進(jìn)行花生的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株T1代種子。

劉強(qiáng)等［21］將在番茄心皮細(xì)胞分裂中起負(fù)調(diào)控作用并影響果重的重要數(shù)量性狀基因fw2.2轉(zhuǎn)化花生品種花育23號(hào)，獲得了12個(gè)PCR陽性的獨(dú)立轉(zhuǎn)化子。半定量RT-PCR結(jié)果表明，該基因在花和葉片中的表達(dá)量較低，而在幼胚中的表達(dá)量較高，且在野生種A.stenasperma的表達(dá)量明顯高于在栽培種魯花11號(hào)。

邱金梅等［22］研究發(fā)現(xiàn)，以帶子葉的胚軸為外植體，在OD600為0.7的菌液中，加入150 mg/L的表面活性劑(MES，methyl ester sulfonate)，40 kPa真空處理10 min，共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行二次侵染，可顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化率，GUS基因陽性表達(dá)率最高，達(dá)73.3%。

高明等［23］以花生下胚軸為外植體轉(zhuǎn)化花生品種四粒紅，在含有0.8 mg/L除草劑Basta(主要成分是草丁膦)的培養(yǎng)基中獲得67株抗性植株，經(jīng)PCR檢測，5株為陽性，bar試紙條檢測至少有2株為陽性。

張廷婷等［24］利用基因芯片技術(shù)從抗、感黃曲霉花生品種中分離出差異表達(dá)基因PnLOX2，通過原核表達(dá)得到分子量為121.5 kD的融合表達(dá)產(chǎn)物，并構(gòu)建了該基因的3'端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化花生，得到了轉(zhuǎn)基因花生苗，為反向鑒定PnLOX2基因在花生抗黃曲霉侵染過程中的功能奠定基礎(chǔ)。陳湘瑜等［25］將擬南芥AtTTG1基因的編碼區(qū)cDNA與“閩花6號(hào)”的花生果種皮特異啟動(dòng)子S19共同構(gòu)建于帶MAR序列的植物表達(dá)載體，旨在利用AtTTG1基因來改變花生果種皮抗黃曲霉這一物理屏障，增強(qiáng)花生抵抗黃曲霉侵染的能力。

Athmaram等［26］將BTVP2基因轉(zhuǎn)入花生體細(xì)胞使其產(chǎn)生抑制病毒的蛋白——藍(lán)舌病外衣殼蛋白。姚慶收等［27］研究表明，以A600為0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601菌液侵染花生葉片，在含50 μmol/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，可以高效地誘導(dǎo)得到花生毛狀根。同時(shí)，任艷等［28］也指出，花生的葉片、子葉、下胚軸均能被發(fā)根農(nóng)桿菌GIM1.141誘導(dǎo)出發(fā)根，相同誘導(dǎo)條件下，各外植體的發(fā)根誘導(dǎo)率為葉片＞子葉＞下胚軸;適宜的菌液浸泡時(shí)間為10 min;附加乙酰丁香酮(100 μmol/L)，發(fā)根誘導(dǎo)率明顯提高。

2.2 基因槍轟擊、花粉管通道與直接轉(zhuǎn)化法 基因槍法本質(zhì)上是一種物理過程，沒有宿主限制，對(duì)單子葉和雙子葉植物都能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。且不受組織類型限制，靶受體類型廣泛，幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細(xì)胞都可以用其進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化。桂大萍等［29］以花生上胚軸為外植體，利用基因槍將含GUS基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒載體轟擊體胚，外植體在添加5 mg/L毒莠定(Picloram)+1 mg/L谷氨酰胺(Glutamine)的MB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的體胚發(fā)生率、產(chǎn)胚數(shù)及植株再生率最高。不同基因型以中花8號(hào)體胚再生率最高(體胚誘導(dǎo)率為55.36%，植株再生率為56.79%)。在氦氣壓力為1 100 psi，轟擊距離為9 cm時(shí)，體細(xì)胞胚 B-葡糖苷酸(GUS)瞬時(shí)表達(dá)率可達(dá)22.95%。

花粉管通道法不需要組織培養(yǎng)，技術(shù)簡單，基因型依賴性小，同時(shí)可以使用無標(biāo)記的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而避免抗生素污染。范乾程等［30］利用花生Oleosin基因的啟動(dòng)子替換了pCAMBIA 1301的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pCAMBIA 1301-Oleosin-pro，通過花粉管通道法導(dǎo)入花生，PCR鑒定和GUS組織化學(xué)染色顯示，50株轉(zhuǎn)基因植株有9株能擴(kuò)增出目的條帶，陽性率為18%，高于之前報(bào)道的1% ～10%;9株陽性轉(zhuǎn)基因植株中有5株子葉能被GUS染色，表明Oleosin基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在油體蛋白中能夠表達(dá)。王亞等［31］也通過花粉管通道法，將攜帶條斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA 2300-PyTPS重組載體導(dǎo)入花生，獲得了T0轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測陽性率為34.7%;半定量RT-PCR分析與近紅外技術(shù)證實(shí)條斑紫菜PyTPS基因?qū)牖ㄉ螅瓤商岣咿D(zhuǎn)基因花生種子的耐鹽性，又對(duì)部分后代種子的品質(zhì)性狀產(chǎn)生影響。

申紅蕓等［32］利用下胚軸縱切轉(zhuǎn)化法，建立了利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生下胚軸形成轉(zhuǎn)基因毛根和根瘤的新方法?；ㄉ屡咻S接種部位都有愈傷組織及毛根凸起形成，誘導(dǎo)率100%;毛根生長約20 d，其長度可達(dá)到10 cm以上，此時(shí)去除花生主根，毛根迅速生長，多級(jí)側(cè)根大量形成，同時(shí)有根瘤形成，說明該方法可以高效地轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)入并整合到花生基因組中，進(jìn)而誘導(dǎo)花生產(chǎn)生大量的毛根，是一個(gè)高效的轉(zhuǎn)化方法。并分別用GFP和GUS 2種檢測方法對(duì)該轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了檢測，證明利用該轉(zhuǎn)化體系可以獲得陽性的轉(zhuǎn)基因毛根和根瘤。該體系中，除前期農(nóng)桿菌的培養(yǎng)在無菌條件下進(jìn)行外，后續(xù)所有試驗(yàn)在普通實(shí)驗(yàn)室條件下即可進(jìn)行，操作簡單，是一個(gè)易于掌握而且高效的研究體系。

3 問題與展望

近10年來，花生基因工程研究取得突破性進(jìn)展，已建立了花生轉(zhuǎn)化和再生體系，但存在基因型差異大、再生率低、生長慢等問題，建立高效穩(wěn)定的花生遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系仍然十分必要。需要加強(qiáng)建立不同基因型花生高效植株再生體系，提高體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)效率，利用組織培養(yǎng)與化學(xué)誘變篩選各種不同抗性材料，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系獲得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，通過遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)新種質(zhì)資源及其應(yīng)用等問題的研究。此外，國內(nèi)研究多使用2，4-D、ZT和6-BA等激素來誘導(dǎo)花生不定芽和體細(xì)胞胚，TDZ作為一種新型高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，已受到越來越多研究者的關(guān)注，TDZ在花生遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系中的作用亦有待于進(jìn)一步研究。

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