激素對蟬擬青霉胞內(nèi)核苷合成的影響

陳安徽，邵 穎，李繼武，韓富海

(1.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，徐州工程學(xué)院，江蘇徐州221008;2.安徽省亳州千草藥業(yè)有限公司，安徽亳州236800)

蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)隸屬麥角菌科(Clavicepitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，又名雌蟬花、蟬棒束孢(Isaria cicadae)，是我國傳統(tǒng)中藥材蟬花(Corcyceps sobolifera)的分生孢子即無性型階段［1－4］。研究表明，蟬擬青霉的人工發(fā)酵培養(yǎng)物中含有多種與天然野生蟬花相同的活性成分，有些活性成分的含量甚至高于野生蟬花及同屬的冬蟲夏草。李瑞雪等［5］采用反相高效液相色譜法對蟬擬青霉RCEF1081人工發(fā)酵菌絲體中的活性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中蟲草素和鳥苷含量是冬蟲夏草的2.8倍。葛飛等［6］通過檢測發(fā)現(xiàn)蟬擬青霉RCEF0943菌株液體發(fā)酵菌絲體中的腺苷含量顯著高于野生蟬花。核苷類物質(zhì)特別是腺苷是蟲草屬真菌的主要功能性活性成分，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的不同生理過程、抑制中樞神經(jīng)元的興奮性、增加冠狀動(dòng)脈血流量、降血壓、減慢心率及抗腫瘤等重要的生理作用［7－10］?，F(xiàn)代研究表明激素對微生物的生長發(fā)育會(huì)產(chǎn)生特定的影響［11－12］。

筆者以6-芐氨基嘌呤(6-BA)和3-吲哚乙酸為考察對象，探索2種激素對蟬擬青霉液體發(fā)酵過程中菌絲體生長及胞內(nèi)總核苷、胞內(nèi)腺苷合成的影響，為人工蟲草資源的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種與試劑。菌種:蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)菌種保存于食品工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。試劑:3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、腺苷、尿苷、胞苷、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司;95%乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基。固體斜面培養(yǎng)基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%、瓊脂2%;種子培養(yǎng)基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%;液體培養(yǎng)基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%。

1.1.3 儀器與設(shè)備。梅特勒電子天平，AE200型，上海分析儀器廠;手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ.SG4﹨.280，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;Freeze Dry Systems(冷凍干燥系統(tǒng))，040520111G，美國LABCONCO公司;SENCO R-502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)公司;高效液相色譜儀LC3100，安徽皖儀科技股份有限公司;高效液相色譜紫外檢測器UV3100，安徽皖儀科技股份有限公司;分析柱Synergi Hydro(4.6 mm ×250 mm，4 μm)，美國 Waters公司;超凈工作臺(tái)，AIR TECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司;光照培養(yǎng)箱，LRH-250-G，廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的發(fā)酵方法。6-BA、3-吲哚乙酸按照5 mg/L的添加比例添加到裝有200 ml液體培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，另配制不添加激素的培養(yǎng)基。于3種培養(yǎng)基中分別按照10%的接種量接種蟬擬青霉液體種子，25℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)并定期測定生物量及胞內(nèi)核苷含量，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 生物量的測定及菌絲體的獲得。菌種培養(yǎng)過程中，每隔24 h取樣，獲得的發(fā)酵醪液抽濾后用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體5次，菌絲體冷凍干燥后準(zhǔn)確稱重。按照下式計(jì)算生物量，干燥菌絲體粉碎過100目篩，備胞內(nèi)核苷含量的檢測。

生物量(g/L)=菌絲體干重(g)/發(fā)酵醪液體積(L)

1.2.3 胞內(nèi)總核苷含量的檢測。準(zhǔn)確稱取腺苷、尿苷、鳥苷、胞苷標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g定容至100 ml，得到4種標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度均為1 mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液稀釋并配制成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/ml的溶液，采用分光光度計(jì)法測定溶液吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入25 ml容量瓶并定容。將溶液再稀釋為0.04 mg/ml后以75%的乙醇作為空白對照測定溶液吸光值。

1.2.4 胞內(nèi)腺苷含量的檢測。腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g置于10 ml容量瓶中，用65%的乙醇定容至刻度;將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成 0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/ml的溶液進(jìn)行HPLC分析并繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品檢測:稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入25 ml容量瓶并定容。溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾后得樣品液，樣品液經(jīng)適當(dāng)稀釋進(jìn)行HPLC分析。

高效液相色譜條件:0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液為A液，甲醇為B液，洗脫梯度設(shè)置為:100%A液5 min、80%A液+20%B液5 min、60%A液+40%B 液20 min、100%B 液10 min、100%A 液10 min;流速 1.0 ml/min，柱溫 25 ℃，UV 檢測波長:260 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用DPS(V3.01)專業(yè)版數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬擬青霉的生物量 由圖1可知，在該試驗(yàn)條件下，6-BA和3-吲哚乙酸均有促進(jìn)蟬擬青霉菌絲體合成的作用。其中6-BA試驗(yàn)組的最大生物量為6.135 g/L，3-吲哚乙酸組的最大生物量為5.860 g/L，空白對照組最大生物量為5.151 g/L，2實(shí)驗(yàn)組與空白對照組相比最大生物量分別提高了19.10%和13.76%，方差分析表明，差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

由圖1還可知，6-BA和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組蟬擬青霉的最大生物量比對照組提前1 d到達(dá)，很大程度上縮短了蟬擬青霉的發(fā)酵周期。

2.2 胞內(nèi)總核苷含量的變化 以各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值為縱坐標(biāo)，總核苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程為 Y=39.35X+0.027 1，R2=0.992 2，線性范圍為0.002 ～0.010 mg/ml，胞內(nèi)總核苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由表1可知，試驗(yàn)組和對照組均在發(fā)酵第3天時(shí)胞內(nèi)總核苷含量達(dá)到最大值。在發(fā)酵前期，2種激素并未對核苷含量產(chǎn)生影響，但在發(fā)酵第3天激素刺激蟬擬青霉胞內(nèi)核苷急劇累積，6-BA和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)總核苷含量分別達(dá)到最大值18.49 mg/g和16.77 mg/g，比對照組的最高含量11.19 mg/g分別提高了65.24%和49.87%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)試驗(yàn)組胞內(nèi)核苷的最高含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。另外，6-BA試驗(yàn)組在第3天總核苷量達(dá)到最高，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行總核苷含量迅速降低，而3-吲哚乙酸試驗(yàn)組在發(fā)酵第3天胞內(nèi)核苷含量達(dá)到最高后并未隨著發(fā)酵過程的推移出現(xiàn)急劇下降的趨勢。

2.3 胞內(nèi)腺苷含量的變化 以不同質(zhì)量濃度的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC峰面積進(jìn)行回歸分析，得到腺苷含量的回歸方程為 Y=14.931X －82.34，R2=0.998 6，線性范圍為 0.025 ～0.200 mg/ml。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。對各組樣品進(jìn)行胞內(nèi)腺苷含量的檢測，結(jié)果見表2。

由表2可知，6-BA和3-吲哚乙酸均對蟬擬青霉液體發(fā)酵過程中胞內(nèi)腺苷的合成產(chǎn)生一定的影響。3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷含量較6-BA組和對照組提前24h達(dá)到最大值。6-BA顯著提高了胞內(nèi)腺苷的含量，最高含量達(dá)到2.32 mg/g，比對照組和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷的最高含量分別提高了32.57%和27.47%。6-BA更有利于蟬擬青霉胞內(nèi)腺苷的合成。

表1 激素對蟬擬青霉發(fā)酵總核苷的影響 mg/g

表2 激素對蟬擬青霉發(fā)酵產(chǎn)腺苷的影響 mg/g

3 討論

隨著天然蟲草資源的枯竭，蟲草已遠(yuǎn)無法滿足市場需求。蟲草無性型菌株液體發(fā)酵菌絲體作為天然蟲草資源的代用品越來越得到人們的追捧。蟲草菌株的液體發(fā)酵及活性物質(zhì)的研究開發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明植物激素和動(dòng)物激素均可調(diào)控微生物的生長發(fā)育過程，激素作為有效的基因開關(guān)可以促進(jìn)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)及物質(zhì)的合成。該研究在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過程中添加6-BA和3-吲哚乙酸2種激素以考察激素對蟬擬青霉代謝途徑的影響。該試驗(yàn)條件下，向蟬擬青霉液體培養(yǎng)基中按照5 mg/L的比例添加6-BA和3-吲哚乙酸，發(fā)現(xiàn)2種激素對蟬擬青霉生物量、胞內(nèi)總核苷和胞內(nèi)腺苷的含量均產(chǎn)生了一定的影響。6-BA與3-吲哚乙酸組生物量較對照組提前1 d達(dá)到最大值，大大縮短了蟬擬青霉的發(fā)酵周期，同時(shí)2種激素也促進(jìn)了胞內(nèi)總核苷和腺苷的合成。腺苷是蟲草屬真菌的主要活性成分之一，目前已作為檢測蟲草類制品質(zhì)量的重要質(zhì)控指標(biāo)，2種激素在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過程中的添加對于提高蟲草相關(guān)制品品質(zhì)發(fā)揮了積極作用，同時(shí)也說明激素確實(shí)會(huì)改變微生物的代謝途徑及生長節(jié)奏。至于激素對蟬擬青霉液體發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生其他活性成分的影響程度及激素不同添加量對活性物質(zhì)累積的影響有待于進(jìn)一步研究。

激素在蟬擬青霉液體發(fā)酵過程中的添加可以縮短發(fā)酵周期，提高胞內(nèi)總核苷和腺苷的含量。該研究的開展將為蟬花有效代用品的開發(fā)提供途徑，為蟲草資源的有效應(yīng)用提供參考。

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