一株苯并芘高效降解菌的篩選鑒定

弓玉紅，李 軍，高 平，王 莉，趙 君 (呂梁學(xué)院，山西離石033000)

苯并芘，分子式為 C20H12，分子量是 252［1］，極不易溶于水。這是它在環(huán)境中難于被降解的因素之一［2－4］。苯并芘是一種強(qiáng)致癌物，具有致癌、致畸、致突變性［5－7］。苯并芘存在于石油、食品、大氣和煤焦油中，在土壤中也易殘留［8－9］。許多國家都進(jìn)行過土壤中苯并芘含量調(diào)查，殘留濃度取決于污染源的性質(zhì)與距離［10］。在焦化廠附近土壤中苯并芘含量為200 mg/kg，在被污染的土壤中高達(dá)650 mg/kg［11］。筆者在山西呂梁市離石區(qū)焦化廠周邊耕地中采集被苯并芘污染的土壤和廢水樣品，分離、篩選到一株苯并芘降解能力較強(qiáng)的菌株A18。經(jīng)鑒定，它屬于木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)。該菌株首次被證實(shí)具有降解苯并芘的能力，具有從環(huán)境介質(zhì)中清除苯并芘的較好效果，在苯并芘污染的微生物修復(fù)上具有很高的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 樣品采自山西呂梁市離石區(qū)焦化廠周邊耕地耕層土壤和廢水。富集用培養(yǎng)基［12－14］1 L:(NH4)2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO41.0 g，Mg-SO40.2 g，溶解苯并芘 5 mg 于丙酮后加水至 1 L，pH 7.5。2216E培養(yǎng)基1 L:蛋白胨5 g，酵母浸膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，pH 7.6 ～7.8。

1.2 苯并芘降解菌分離方法 稱取10 ml土樣和水樣的混合樣，加入到90 ml無菌水中，加入適量玻璃珠，振蕩3 h［15－17］。30 min 靜置后，取5 ml上清液到 45 ml含有苯并芘濃度為1 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min搖床避光培養(yǎng)。每隔7 d移取10 ml菌液至滅菌的90 ml無機(jī)鹽－苯并芘液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接一次苯并芘的濃度提高1 mg/L，如此4次后，苯并芘的最后濃度為5 mg/L。將最后一次的培養(yǎng)液稀釋不同的梯度(10－1～10－7)，涂布于表面涂有苯并芘的選擇性固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2 d。分別挑取單菌落，接種到2216E固體平板液體培養(yǎng)基中，反復(fù)劃線，分離，經(jīng)28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d，得到純培養(yǎng)物，并且觀察菌落形態(tài)，測量菌落大小，記錄結(jié)果后斜面保存菌株。

1.3 降解菌的鑒定

1.3.1 分離菌株形態(tài)特征分析。菌株形態(tài)特征分析參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《真菌鑒定手冊》［18］等進(jìn)行。

1.3.2 16S rDNA的測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。挑取適量菌株于含有100 μl ddH2O的1.5 ml離心管，研磨形成菌液，將77.5 μl菌液分別加入每管含有 10 μl buffer、12.5 μlDTT 的PCR管中，65℃水浴處理20 min，然后離心，置于冰上進(jìn)行20 min處理，取上清為PCR反應(yīng)的模板。把總DNA稀釋至100 ng/μl，用稀釋液為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，以蒸餾水為陰性對照，50 μl反應(yīng)體系進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，然后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，產(chǎn)物送上海桑尼生物工程公司測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行序列搜索比對后，選擇親緣關(guān)系較近的幾種菌株作為參比菌株，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［19］。

1.3.3 苯并芘含量的測定。采用萃?。贤夥止夤舛确?，測定苯并芘含量［20］。用二氯甲烷試劑，配制梯度苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計在300 nm波長處測定其梯度吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，在篩選得到的每種菌株的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入丙酮－苯并芘母液，使得苯并芘的終濃度達(dá)到5 mg/L。在轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度28℃的條件下振蕩培養(yǎng)12 d，同時設(shè)不接菌對照。用紫外分光光度計分別在300 nm波長處測定其吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出樣品中剩余的苯并芘含量。

1.3.4 苯并芘降解率的計算。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中剩余苯并芘的含量，再利用公式c=(a－b)/a×100%計算降解率。式中，c為降解率;a為空白樣品中苯并芘的含量;b為處理后剩余苯并芘的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并芘降解率的測定 以苯并芘為唯一碳源從焦化廠周邊耕地耕層土壤和廢水中篩選出一株降解菌，命名為A18。對A18進(jìn)行苯并芘降解率測定。

由圖1可知，試驗(yàn)得到苯并芘濃度在1.0～3.0 mg/L的范圍內(nèi)呈良好線形關(guān)系。對樣品的吸光度值測定，樣品的吸光度值為0.069，對照為0.135。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的 y=0.427 4x－0.103 5計算得出對照的降解率(a)為0.557，樣品的降解率(b)為0.307。利用公式c=(a－b)/a×100%計算降解率(c)，為44.8%。由此可知，菌株 A18在苯并芘濃度為5 mg/L，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28℃的條件下，振蕩培養(yǎng)12 d，苯并芘的降解率為44.8%。

2.2 苯并芘降解菌的篩選與鑒定 菌株A18在PDA培養(yǎng)基上為氣生菌絲，米黃色，較疏松，棉絮狀。大型分生孢子紡錘形或鐮刀形，基部有明顯的腳胞，頂端細(xì)胞均勻地逐漸狹細(xì)，平直或稍彎曲。小型分生孢子較少，為長矩圓形或橢圓形，分生孢子梗為短梗形。厚垣孢子頂生或間生，成結(jié)節(jié)狀或成串。根據(jù)上述形態(tài)特征，參考Booth鐮刀菌分類系統(tǒng)，鑒定該菌株為木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的A18號菌的18S rRNA序列(NCBI序列號為 GQ505743.1)，與 GenBank中已報道的鐮孢霉屬(Fusarium LK.ex Fr.)真菌的18S rRNA序列有98%的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，A18與彎鐮孢霉組(赤霉屬Gibbosum/Gibberella)真菌的一些已鑒定菌株(序列號為AY147368及AY147363)同屬于一個簇群。根據(jù)A18的形態(tài)學(xué)特征、18S rRNA序列分析結(jié)果，參照鐮孢霉屬的分類學(xué)，將其鑒定為一種木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)。其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖2。

3 結(jié)論

以苯并芘為唯一碳源，從焦化廠周邊耕地耕層土壤和廢水中篩選出一株高效降解菌A18，經(jīng)鑒定為木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)。在苯并芘濃度為5 mg/L，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28℃的條件下，振蕩培養(yǎng)12 d，該菌的苯并芘降解率為44.8%。

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