4－苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物抑制HIV-1的初步研究＊

張龍鋒，邱 敏，蔣麗軍，劉 強，焦志軍，吳稚偉△

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.南京大學醫(yī)學院，南京 210008；3.揚州市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇揚州 225001）

4－苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物抑制HIV-1的初步研究＊

張龍鋒1，邱 敏2，蔣麗軍3，劉 強1，焦志軍1，吳稚偉2△

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.南京大學醫(yī)學院，南京 210008；3.揚州市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇揚州 225001）

目的研究4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物（PSM）對HIV-1的抑制作用。方法通過Luciferase檢測不同濃度的PSM對易感細胞GHOST（3）X4／Hi5中HIV-1的抑制作用，觀察PSM對北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2和中國臨床分離株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制作用；利用CCK8試劑盒測定PSM對VK2／E6E7生長的抑制率來觀察PSM的體外細胞毒性。通過逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測生殖道上皮細胞 HEC-1-A的緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occludin的表達，觀察PSM對生殖道上皮細胞HEC-1-A表達的緊密連接蛋白的影響從而間接評價其對局部黏膜完整性的影響。結(jié)果PSM對北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2以及中國常見臨床分離株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制EC50分別為5.78、0.77、1.85、3.15、1.70和2.27μg／mL，具有抗 HIV-1感染的活性；PSM 對 VK2／E6E7細胞具有低毒性；PSM 不明顯抑制 ZO-1的表達且增加了E-cadherin和Occludin的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論PSM可以抑制HIV-1感染，具有作為殺微生物劑的潛能。

4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物；抗病毒；HIV-1

自從1981年發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病以來，全世界每天有約15 000新增感染者［1］。截止2014年2月，我國官方報告現(xiàn)有HIV感染者40多萬［2］。傳播途徑中性傳播占有非常重要的位置，最近的研究顯示，超過90%的新近感染者是通過無防護的性交產(chǎn)生的。女性在無防護性交過程中較男性更容易感染HIV以及其他生殖道性病，所以研究開發(fā)女性可控的局部殺微生物劑具有十分重要的意義［3－7］。過去幾年有較多的抗HIV的藥物研究和報道［1，3－7］，但是目前仍沒有理想的局部殺微生物劑的問世，所以研究開發(fā)預(yù)防性藥物－局部殺微生物劑具有十分重要的意義。目前發(fā)現(xiàn)苯乙烯磺酸鈉及其共聚化合物4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物 （4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid，PSM）具有阻斷性傳播疾病的作用［7－8］。本文初步研究了PSM抗人類免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）的活性及其生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 PSM購于Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；qRT-PCR試劑購自日本TOYOBO公司；熒光素酶（Luciferase）檢測試劑盒購自美國Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine-2000購自美國Invitrogen公司；HEC-293T、VK2／E6E7細胞購于美國ATCC。GHOST（3）X4／Hi5來源于美國NIH AIDS Research and Reference Reagent Program；HIV-1／VSV-G假病毒，質(zhì)粒 pNL4-3E-R-Luc來自清華大學張林琦教授。HIV-1假病毒的構(gòu)建參照Connor等［9］和 He等［10］的方法進行。將293T細胞接種于10cm的培養(yǎng)皿中，待細胞密度達到90%以上時，利用聚乙二醇 （PEG）將pNL4-3 E-R-Luc和Env質(zhì)粒按照2∶1的比例轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后16h換液。轉(zhuǎn)染48h后，收集上清液，分裝凍存于－80℃環(huán)境。將病毒液進行10倍梯度稀釋，接種于生長在96孔板中的GHOST（3）X4／Hi5細胞中，48h后利用Promega Luminometer檢測Luciferase活性來確定病毒滴度。病毒的滴度用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50）表示［11－12］。

1.2 方法

1.2.1 PSM抗HIV-1感染的活性檢測 將PSM進行梯度稀釋，加入到96孔板中。將病毒液稀釋到4 000TCID 50／mL，每孔加入50μL，放置于37℃孵育1h。孵育完畢后，在每孔中接種104個GHOST（3）X4／Hi5細胞，于37℃，5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，加入100μL Promega Glo-Lysis buffer進行裂解。再取一空白96孔板，每個相應(yīng)孔加入50 μL細胞裂解液隨后加入50μL Luciferase底物，然后迅速混勻，立即用Promega Luminometer測定Luciferase活性，計算病毒感染率。利用HIV-1假病毒感染系統(tǒng)來觀察PSM對試驗毒株（北美HIV-1毒株R5型JR-FL和X4型HXB2和中國臨床分離株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55）的抗病毒活性。

1.2.2 PSM的細胞毒性實驗 將VK2／E6E7或GHOST（3）X4／Hi5細胞分別接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)約為104個，于37℃，5%CO2培養(yǎng)24h。將PSM進行梯度稀釋，取每種濃度的PSM 50μL加入到各孔中。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL的CCK8工作液，于37℃，5%CO2孵育2～4h，于450nm處測定每孔的吸光值，計算藥物對細胞生長的抑制率。

1.2.3 HEC-1-A緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和 Occludin的RNA抽提和qRT-PCR的檢測 按照試劑說明書進行RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄并進行檢測。使用Life Technology的SYBR Green Mix進行qRT-PCR檢測，其中使用的PCR引物如下，ZO-1上游引物為：5′-AAG TCA CAC TGG TGA AAT CC-3′，下游引物為：5′-CTC TTG CTG CCA AAC TAT CT-3′，產(chǎn) 物 大 小 102bp；E-cadherin上 游 引 物 為：5′-AGG CCA AGC AGC AGT ACA TT-3′，下游引物為：5′-ATT CAC ATC CAG CAC ATC CA-3′，產(chǎn)物大小110bp；Occludin上游引物為：5′-CAT TGC CAT CTT TGC CTG TG-3′，下游引物為：5′-AGC CAT AAC CAT AGC CAT AGC-3′，產(chǎn)物大小149bp；GAPDH 上游引物為：5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′，下游引物為：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-5′，產(chǎn)物大小87bp。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PSM具有抗HIV-1感染的活性 PSM對試驗毒株感染GHOST（3）X4／Hi5細胞的抑制作用的半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別為5.78、0.77μg／mL，對中國臨床分離毒感染GHOST（3）X4／Hi5細胞的抑制作用EC50從1.70μg／mL到3.15μg／mL（表1）。PSM 對北美 HIV-1毒株JR-FL和 HXB2均有很強的抑制作用，為了觀察PSM抑制HIV-1假病毒感染是否依賴于病毒膜蛋白本研究還觀察了PSM對VSV-G假病毒的抑制作用（圖1）。發(fā)現(xiàn)即使當PSM濃度達到20μg／mL時，依然沒有表現(xiàn)出明顯的病毒抑制活性。這說明，PSM抑制HIV-1對易感細胞的感染依賴于病毒膜蛋白160。

2.2 PSM對VK2／E6E7細胞具有低毒性 高濃度（10 000 μg／mL）PSM 與 VK2／E6E7孵育6、12和24h后，其對細胞的細胞毒作用很小，60%以上VK2／E6E7細胞仍然能夠存活（圖2）。在藥物和細胞相互作用48h后，凋亡細胞與全部細胞之比為50%時所對應(yīng)的藥物濃度（IC50）也大于6 000μg／mL，遠遠大于藥物抗病毒的EC50值（0.77～5.76μg／mL）。

表1 PSM 對 HIV-1感染 GHOST（3）X4／Hi5細胞的抑制作用

圖1 PSM對JR-FL，HXB2和VSV-G假病毒感染GHOST（3）X4／Hi5細胞的抑制結(jié)果

圖2 PSM對VK2／E6E7細胞的低細胞毒作用

2.3 PSM對陰道乳酸桿菌的生長的影響 本研究觀察了PSM對于陰道乳酸桿菌陰道生長的影響情況（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSM對陰道乳酸桿菌生長沒有影響，即使在最高PSM濃度下（50 000μg／mL），陰道乳酸桿菌的生長密度沒有明顯變化。

2.4 PSM對上皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白表達的影響 本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測了PSM是否會降低生殖道上皮細胞 HEC-1-A的緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和 Occludin的表達（圖4）。發(fā)現(xiàn)PSM并不明顯抑制ZO-1的表達，相反增加了E-cadherin和Occludin的轉(zhuǎn)錄水平。而陽性對照TNF-α對3種細胞緊密連接蛋白均有下調(diào)作用。

圖3 PSM對陰道乳酸桿菌生長的影響

圖4 PSM對HEC-1-A細胞緊密連接蛋白表達的影響

3 討 論

易感細胞表面表達的CD4分子是HIV感染宿主細胞的受體，然而完成感染還需要輔助受體CCR5或者CXCR4分子［13－15］。GHOST （3）X4／Hi5細胞是人骨髓瘤細胞經(jīng)過基因工程構(gòu)建后能夠穩(wěn)定表達HIV病毒感染宿主細胞所需要的CD4受體分子及其所需要的輔助受體CCR5和CXCR4分子的細胞。GHOST（3）X4／Hi5是HIV易感細胞，可用于病毒滴度檢測和觀察PSM對HIV-1的抑制活性。VK2／E6E7細胞是人陰道上皮細胞株，可以在體外檢測PSM的細胞毒性即安全性。本研究所用到的6株試驗毒株（JR-FL、HXB2、CNE6、CNE30、CNE50和CNE55）代表了B、B′、B′C和 AE亞型。JR-FL是CCR5嗜性的，HXB2是CXCR4嗜性的，其余的從中國患者外周循環(huán)血中分離得到［9］，也具有不同的嗜性和很好的代表性。本研究結(jié)果顯示PSM對所選的實驗毒株具有較好的抑制作用。理想的預(yù)防藥物殺微生物劑所必須具備的首要條件就是安全，所以本研究隨后觀察了PSM對陰道上皮細胞、陰道正常共生菌群（乳酸桿菌）和局部黏膜的完整性的影響。結(jié)果表明PSM對陰道上皮細胞株VK2／E6E7細胞具有低毒性；對陰道的正常菌群陰道乳酸桿菌的生長亦無明顯的抑制作用；PSM對上皮細胞間的緊密蛋白轉(zhuǎn)錄水平僅輕微影響ZO-1的表達，但是促進了E-cadherin和Occludin這兩種緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，說明PSM沒有破壞上皮細胞間的完整性。

綜上所述，本實驗中PSM能夠有效抑制HIV-1感染其作用強度表現(xiàn)一定范圍濃度內(nèi)的劑量依賴性。同時PSM還具有低細胞毒性和維持黏膜的完整性的特點，符合安全性要求。但其相關(guān)機制方面的研究還需進一步探索。

［1］Balzarini J，Van Damme L.Microbicide drug candidates to prevent HIV infection［J］.Lancet，2007，369（9563）：787-797.

［2］中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心.2014年2月全國艾滋病性病疫情及主要防治工作進展［J］.中國艾滋病性病雜志，2014，20（2）：75.

［3］Stone A.Microbicides：a new approach to preventing HIV and other sexually transmitted infections［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1（12）：977-985.

［4］Geuenich S，Goffinet C，Venzke S et al.Aqueous extracts from peppermint，sage and lemon balm leaves display potent anti-HIV-1activity by increasing the virion density［J］.Retrovirology，2008，5：27.

［5］Li L，He L，Tan，S et al.3-Hydroxyphthalic anhydridemodified chicken ovalbumin exhibits potent and broad anti-HIV-1activity：apotential microbicide for preventing sexual transmission of HIV-1［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（5）：1700-1711.

［6］Qiu M，Wang Q，Chu Y，et al.Lignosulfonic acid exhibits broadly anti-HIV-1activity－potential as a microbicide candidate for the prevention of HIV-1sexual transmission［J］.PLoS One，2012，7（4）：e35906.

［7］Anderso RA，F(xiàn)eathergill K，Diao X，et al.Evaluation of poly（styrene-4-sulfonate）as a preventive agent for conception and sexually transmitted diseases［J］.J Androl，2000，21（6）：862-875.

［8］陳鈺，宋思維，邱敏，等.4－苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物抑制 HSV-2感染研究［J］.東南大學學報：醫(yī)學版，2012，31（5）：563-566.

［9］Connor RI，Chen BK，Choe S，et al.Vpr is required for efficient replication of human immunodeficiency virus type-1 in mononuclear phagocytes［J］.Virology，1995，206（2）：935-944.

［10］He J，Choe S，Walker R，et al.Human immunodeficiency virus type 1viral protein R（Vpr）arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2activity［J］.J Virol，1995，69（11）：6705-6711.

［11］Johnson V，Byington R.Infectivity assay（virus yield assay）.Techniques in HIV research［M］.New York：Stockton Press，1990：71-76.

［12］Montefiori DC.Measuring HIV neutralization in a luciferase reporter gene assay［J］.MethodsMol Biol，2009（485）：395-405.

［13］Wyatt R，Sodroski J.The HIV-1envelope glycoproteins：fusogens，antigens，and immunogens［J］.Science，1998，280（5371）：1884-1888.

［14］Chan DC，Kim PS.HIV entry and its inhibition［J］.Cell，1998，93（5）：681-684.

［15］Shang H，Han X，Shi X，et al.Genetic and neutralization sensitivity of diverse HIV-1env clones from chronically infected patients in China［J］.J Biol Chem，2011，286（16）：14531-14541.

The preliminary research of PSM on the inhibition of HIV-1＊

Zhang Longfeng1，Qiu Min2，Jiang Lijun3，Liu Qiang1，Jiao Zhijun1，Wu Zhiwei2△
（1.Department of Clinical Test，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu212001，China；2.Medical College of Nanjing University，Nanjing，Jiangsu210008，China；3.Department of Pediatric，the First People′s Hospital of Yangzhou City，Yangzhou，Jiangsu225001，China）

ObjectiveTo investigate the inhibiton effect of 4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid（PSM）in HIV-1.MethodsThe inhibition effect of different doses of PSM on HIV-1in susceptible cells GHOST （3）X4／Hi5was observed by Luciferase，and so did the inhibitory effect of PSM on JR-FL、HXB2、CNE6，CNE30，CNE50，CNE55.The cellular toxicity of PSM on the VK2／E6E7 was also evaluated by CCK8kit.The transcript level of tight junction proteins（ZO-1，E-cadherin and Occludin）of HEC-1-A were analyzed by qRT-PCR.And then observed the effect of PSM on expression of genitourinary epithelial cells HEC-1-A，so we could evaluated the effect of integrity of local mucosal indirectly.ResultsThe results showed that PSM exhibited potent antiviral activity against a broad spectrum of HIV-1major isolates with different genotypes and biotypes（EC50value of JR-FL，HXB2，CNE6，CNE30，CNE50，CNE55were 5.78，0.77，1.85，3.15，1.70，2.27μg／mL respectively）.Meanwhile，it had less cytotoxicity on VK2／E6E7.qRT-PCR showed that no obvious restrain effect on expression of ZO-1was observed and PSM increased the level of transcription of E-cadherin and Occludin.ConclusionPSM may be a potential agent for the prevention of HIV-1infection.

4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid；antiviral；HIV-1

R373.9

A

1671-8348（2015）01-0001-03

10.3969／j.issn.1671-8348.2015.01.001

國家衛(wèi)計委“十二五”傳染病重大專項項目（2012ZX10001007-009）；江蘇大學醫(yī)學臨床科技發(fā)展項目基金資助項目（JLY20120169）。

張龍鋒（1980－），主管檢驗師，碩士，主要從事免疫學方向研究?！?/p>

，Tel：（025）83686092；E-mail：wzhw＠nju.edu.cn。

2014-08-18

2014-10-30）

·論 著·