呂小義,付杰,尹佳,田華,陳濤,何東平*
(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430023;2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢430071)
高產(chǎn)DHA裂壺藻突變株的選育
呂小義1,付杰1,尹佳1,田華1,陳濤2,何東平1*
(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430023;2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢430071)
利用60Co-γ射線輻照誘變裂壺藻(Schizochytrium limacinum)ATCC20888,以平板生長情況、生物量、含油率和二十二碳六稀酸(DHA)產(chǎn)量為綜合指標(biāo),最終選育出一株高產(chǎn)突變株,命名為1.6-7-1,其搖瓶發(fā)酵生物量為47.37 g/L,油脂含量為31.41%,DHA產(chǎn)量為5.65 g/L,且DHA產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了約40%,經(jīng)連續(xù)5代發(fā)酵培養(yǎng),其遺傳性能穩(wěn)定。
60Co-γ射線;裂壺藻;二十二碳六烯酸
自世界衛(wèi)生組織正式推薦嬰幼兒生長發(fā)育的早期階段要及時補充二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),其就以其獨特的生理功能愈發(fā)成為人們關(guān)注的焦點[1-3]。近年來,DHA行業(yè)迅猛發(fā)展,產(chǎn)量逐年上升。因此開發(fā)高效低廉的DHA生產(chǎn)工藝不僅有助于改善目前DHA研發(fā)生產(chǎn)現(xiàn)狀,更可以推廣至其他多不飽和脂肪酸類產(chǎn)品的開發(fā)[4-7]。
DHA俗稱腦黃金,是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸,因其含有6個不飽和烯鍵的特有結(jié)構(gòu),使它具有獨特的生理功能和經(jīng)濟價值,對人類健康有著特殊的作用和影響[8-9]。
裂壺藻(Schizochytrium limacinum)又稱裂殖壺菌,是一類富含DHA的海洋藻類,因其生長速度快、易于培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成簡單易于提純等優(yōu)勢,被認(rèn)為是一種極具潛力的DHA新來源[10-13]。
美國Martek公司在微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA領(lǐng)域進行了深入研究,將裂壺藻發(fā)酵生物量提高至200 g/L,DHA產(chǎn)量提升至40 g/L,居世界領(lǐng)先水平。近年來國內(nèi)高校對裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)DHA也開展了研究,并取得一定進展,但產(chǎn)量和質(zhì)量均較國外尚有一定差距,不能夠滿足巨大的市場需求。
本研究以裂壺藻(Schizochytrium limacinum)ATCC 20888為出發(fā)菌株,利用60Co-γ射線對其進行輻照誘變,篩選出最優(yōu)突變株[14],用以改善生長培養(yǎng)條件,增加生物量,累積較多的油脂和DHA,用以達到工業(yè)生產(chǎn)的目的[15-17]。
1.1 材料與試劑
1.1.1 菌種
裂壺藻(Schizochytrium limacinum)ATCC20888:廣東微生物菌種保藏中心。
1.1.2 培養(yǎng)基
平板與斜面培養(yǎng)基:葡萄糖50 g/L,谷氨酸鈉30 g/L,酵母膏6 g/L,NaCl 8 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO46 g/L,金屬離子混合液2 mL。
種子培養(yǎng)基:葡萄糖85 g/L,谷氨酸鈉60 g/L,酵母膏6 g/L,NaCl 20 g/L,KH2PO46 g/L,MgSO422 g/L,Na2SO40.3 g/L,金屬離子混合液2 mL。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖75 g/L,谷氨酸鈉15 g/L、酵母膏6g/L、NaCl2.4g/L,KH2PO44.8g/L,MgSO46g/L,KCl0.4g/L,金屬離子混合液2.8 mL。
1.1.3 化學(xué)試劑
葡萄糖、碳酸氫鈉、硫酸鈉:天津博迪化工股份有限公司;酵母膏:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;磷酸二氫鉀:天津凱通化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶(20萬U/g)、纖維素酶(5萬U/g):江蘇銳陽生物科技有限公司;實驗所用試劑均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 7890A氣相色譜儀:安捷倫科技(中國)有限公司;SPX-150C恒溫恒濕箱、9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;HYQ-150S全溫?fù)u床:武漢匯誠生物科技有限公司;GZX-XB-K-25血球計數(shù)板:鹽城市榮康玻璃儀器有限公司;60Co-γ輻照源:湖北省農(nóng)科院輻照中心。
1.3 方法
1.3.1 菌種活化
將菌種轉(zhuǎn)接至富集培基上,于26℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)2~3 d。菌種經(jīng)富集后,在分離平板上劃線分離,26℃恒溫培養(yǎng),經(jīng)多次分離獲得裂壺藻單菌落菌株。挑選純的單菌落作為活化種子轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。
1.3.2 種子培養(yǎng)
從平板中純的單菌落處挑取一環(huán),轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中,置于搖床上26℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。
1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)
將種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4~5 d。
1.3.4 制備待誘變懸浮液
從活化后的裂壺藻種子中挑選出菌落較大、較純,生長較快的進行鏡檢,選擇細(xì)胞較大,特征典型的經(jīng)種子培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對數(shù)期。離心去除上清液,用無菌生理鹽水制成懸浮液,血球計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度在107~109CFU/mL,待誘變處理。
1.3.560Co-γ輻照誘變
取12支滅菌過的試管,每管分別裝入上述懸浮液5 mL。每3個為一組,共分為4組,在湖北省農(nóng)科院輻照中心進行60Co-γ射線輻照,各組劑量分別為0.4 kGy、0.8 kGy、1.2 kGy、1.6 kGy,剩下的原懸浮液作為對照組。菌株致死率計算公式如下:
式中:A為未經(jīng)誘變平板上的菌落數(shù),CFU;B為經(jīng)過誘變后平板上的菌落數(shù),CFU。
1.3.6 突變株的篩選
經(jīng)過誘變處理的懸浮液經(jīng)適量稀釋平板涂布,26℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落長勢、大小并記錄菌落數(shù)。挑選形態(tài)大,表面光滑的單菌落進行初篩,然后對初篩得到的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)篩,26℃、180 r/min培養(yǎng)5 d,檢測其生物量、油脂含量、DHA產(chǎn)量,保存產(chǎn)量較高的菌種。
1.3.7 突變株遺傳穩(wěn)定性測試
將復(fù)篩得到的突變株連續(xù)傳至5代,再對其進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),測定生物量、含油量和DHA產(chǎn)量并與初代進行比較,觀察其遺產(chǎn)穩(wěn)定性。
1.3.8 生物量的測定
裂壺藻的生物量以收集的菌體細(xì)胞干質(zhì)量計。取一定體積的培養(yǎng)液裝入預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中,5 000 r/min離心20 min,沉淀用蒸餾水清洗3次,置于干燥箱中,60℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,稱質(zhì)量。生物量的計算公式如下:
1.3.9 油脂的提取及DHA含量測定
藻油的提取:將離心洗滌得到的藻泥與水按料液比1∶1(g∶mL)混合,用堿性蛋白酶0.5%和纖維素酶0.025%在60℃條件下酶解6 h,真空冷凍干燥至質(zhì)量恒定,研磨成藻粉,用乙醚索氏抽提至菌體至無色,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)殘留溶劑,置于烘箱干燥至兩次質(zhì)量變化<0.2 mg,計算油脂質(zhì)量。油脂產(chǎn)量及含油率的計算公式如下:
DHA含量檢測:取0.1 g藻油,加1 mL苯-石油醚體積比為1∶1的混合溶劑,再加1 mL 0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液,搖勻,在室溫條件下靜置8~10 min,然后加蒸餾水使醚層升至瓶頸部,待液層澄清后,經(jīng)氣相色譜分析得到DHA相對含量。DHA產(chǎn)量計算公式如下:
DHA產(chǎn)量(g/L)=油脂產(chǎn)量(g/L)×DHA含量(%)
1.3.10 氣相色譜分析條件
色譜柱:Agilent SP-2560(100 m×25 μm,0.2 μm);升溫程序:100℃保持4 min,以3℃/min升溫至230℃,保持20 min,載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣量1 μL;分流比15∶1。
2.160Co-γ射線輻照對裂壺藻ATCC20888的致死效應(yīng)
裂壺藻ATCC20888經(jīng)過不同劑量的輻照處理后,劑量與裂壺藻致死率之間的關(guān)系如圖1所示。由圖1可知,不同劑量對ATCC20888菌株均有致死效應(yīng),且致死率與60Co-γ射線輻照劑量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān),劑量越大,菌株致死率越高。當(dāng)輻照劑量為0.8kGy時,致死率為98.76%,輻射劑量為1.6 kGy時,致死率為99.985%。
2.2 初篩
挑取4個輻照處理組中直徑較大的菌落,每組選20個,共80個單菌落,每個菌落劃2個平板,共160個平板。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。
在以上160個平板中挑選生長快速、無污染、單菌落多且直徑大的平板,在其中挑選出40個單菌落平板劃線,分別命名為0.4-1~0.4-10、0.8-1~0.8-10、1.2-1~1.2-10、1.6-1~1.6-10置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。通過比較菌落大小,形狀、顏色、透明度、鏡檢細(xì)胞大小、污染度、生物學(xué)特征等指標(biāo),篩選出24單株。其中包括0.4 kGy 4株,0.8 kGy 6株,1.2 kGy 5株,1.6 kGy 9株。
將以上挑選出的24單株各取一環(huán)接入裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中,每株接入3管,共72個試管,置于搖床上,26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后進行涂片、蘇丹黑B染色、顯微鏡鏡檢。根據(jù)污染與否、細(xì)胞大小、培養(yǎng)液澄清度、油脂積累量等綜合指標(biāo)篩選出較好的24株,其中包括0.4 kGy處理組4株,0.8 kGy處理組6株,1.2 kGy處理組4株,1.6 kGy處理組10株。準(zhǔn)備復(fù)篩。
2.3 搖瓶復(fù)篩
2.3.1 第一輪復(fù)篩
將初篩得到的24株突變菌株和1株出發(fā)株分三個批次分別經(jīng)種子培養(yǎng)后,以10%接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,置于搖床上,在26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。放瓶后每株分別取樣進行涂片和蘇丹黑B染色鏡檢。每株菌株的發(fā)酵液在40~55℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,測定干質(zhì)量。其結(jié)果見表1。
由表1可知,經(jīng)誘變后的24株突變株與出發(fā)株相比,其平均生物量大部分都有小幅度提升。根據(jù)24株突變株的生長發(fā)育情況、蘇丹黑B染色鏡檢結(jié)果及生物量等指標(biāo),與出發(fā)株相比篩選出較好的7株(0.4-7-2、0.4-9-1、0.8-6-2、1.2-5-1、1.6-1-1、1.6-7-1、1.6-9-3)進行下一輪的篩選。
2.3.2 第二輪復(fù)篩
將上輪篩選出的7株突變株與出發(fā)菌株經(jīng)種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d,取樣涂片和蘇丹黑B染色鏡檢、以生物量、油脂含量、DHA產(chǎn)量為指標(biāo)篩選最優(yōu)突變株。結(jié)果(表2)可知,1.6 kGy劑量下有2株突變株其DHA產(chǎn)量超過5 g/L,可以猜想高劑量的輻照強度對正突變有利。經(jīng)各項指標(biāo)比較分析,選出3株較優(yōu)菌株分別為0.8-6-2、1.6-7-1、1.6-9-3。
2.3.3 第三輪復(fù)篩
第三輪復(fù)篩結(jié)果見表3。由表3可知,突變株1.6-7-1其各項指標(biāo)都優(yōu)于出發(fā)株和其他突變株。經(jīng)過幾輪篩選,選出最優(yōu)突變株1.6-7-1,其生物量為47.37 g/L,DHA產(chǎn)量為5.65 g/L。
2.4 突變株遺產(chǎn)穩(wěn)定性實驗
經(jīng)過初篩復(fù)篩選出的正突變株1.6-7-1,經(jīng)過5代連續(xù)轉(zhuǎn)接后進行發(fā)酵培養(yǎng),比較每代菌株發(fā)酵5 d后生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量,結(jié)果見表4。由表4可知,該突變株遺產(chǎn)性能較為穩(wěn)定,其油脂產(chǎn)量均有大幅度提升,證明了輻照誘變的可行性和科學(xué)性。
2.5 脂肪酸組成分析
將1.6-7-1突變株經(jīng)發(fā)酵所產(chǎn)的藻油進行氣相色譜分析,結(jié)果見表5。由表5可知,裂壺藻脂肪酸組成主要為C16∶0和C22∶6n-3,其中二十二碳六烯酸(DNA)的含量達到了39.92%,表明1.6-7-1突變株經(jīng)發(fā)酵所產(chǎn)的藻油是DNA的良好來源。并且其脂肪酸組成簡單,利于提純。
本實驗利用60Co-γ射線在1.6 kGy的輻射劑量下誘變,最終篩選得到了一株命名為1.6-7-1的高產(chǎn)DHA的裂壺藻突變株,其平均DHA產(chǎn)量為比出發(fā)株提高了約40%,其藻油脂肪酸組成簡單,利于提純,具有良好的商業(yè)前景,在以后的研究中可采取復(fù)合誘變或者基因重組的方法,同時優(yōu)化培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,有望進一步提高DHA產(chǎn)量,縮小商業(yè)成本。
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Lü Xiaoyi1,FU Jie1,YIN Jia1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dongping1*
(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)
Schizochytrium limacinumATCC20888 was mutated by60Co-γ ray irradiation.Using flat growth condition,biomass,oil content and docosahexaenoic acid(DHA)yield as comprehensive indexes,a mutant strain 1.6-7-1 with high DHA yield was screened.The biomass of the strain was 47.37 g/L,oil content was 31.41%,and DHA yield was 5.65 g/L,which was increased by about 40%than the original strain.After five consecutive generationsoffermentation,itsgenetic stabilitykeptwell.
60Co-γ ray;Schizochytrium limacinum;docosahexaenoic acid
Q933
A
0254-5071(2015)04-0106-04
10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.024
2015-03-24
國家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項(201313012-03)
呂小義(1991-),男,碩士研究生,研究方向為微生物油脂。
*通訊作者:何東平(1957-),男,教授,博士,研究方向為糧食、油脂及植物蛋白。