山茱萸中有益菌的分離和鑒定

唐艷敏，孫思佳，翟政濤，紀(jì)飛

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

山茱萸中有益菌的分離和鑒定

唐艷敏，孫思佳，翟政濤，紀(jì)飛

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

將藥用植物山茱萸作為有益菌的分離源，以獲得常見有害菌的抗性菌，提高山茱萸的利用價(jià)值。以馬鈴薯葡萄糖瓊脂和營養(yǎng)瓊脂平板分離、純化其體外真菌和細(xì)菌，對(duì)獲得的菌株進(jìn)行黑曲霉、黃曲霉和大腸桿菌等有害菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，并對(duì)抗性菌進(jìn)行分子生物學(xué)和生理生化的種屬鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從山茱萸中分離純化28株菌（12株細(xì)菌、16株真菌），其中2株菌對(duì)黑曲霉、黃曲霉有一定的抑菌效果，經(jīng)分子生物學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，菌株S136是腸桿菌屬（Enterobactersp.）、菌株S138是芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的細(xì)菌。

山茱萸；有益菌；分離鑒定；抗黑曲霉；抗黃曲霉

有益菌即對(duì)人體健康有益或是對(duì)人類生命活動(dòng)有益的微生物[1]。篩選有益菌的原則是在自然對(duì)抗?fàn)顟B(tài)下，尋找能為人類不同生命活動(dòng)所用的菌株[2]；自1993年STIERLE A[3]等從短葉植物紅豆杉內(nèi)分離出了一株能產(chǎn)紫杉醇的菌株后，植物成了除去土壤和水體外，人們尋找有益菌的另一來源；有益菌具有抗菌[4]、抗蟲[5]、防腐[6]等作用，因此對(duì)于這類微生物的篩選具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是一種落葉灌木，在河南、甘肅、浙江、湖南等省均有分布，其果實(shí)別稱山萸肉，是一種藥用價(jià)值極高的植物，具有補(bǔ)血固精、補(bǔ)益肝腎、調(diào)氣、補(bǔ)虛、明目等功效[7]，被作為六味地黃丸的主要原料藥使用[8]，對(duì)其體內(nèi)外微生物資源的挖掘是充分利用微生物自然資源、提高藥用植物利用（應(yīng)用）價(jià)值的一種較好的方法[9]。本試驗(yàn)將山茱萸作為有益菌的微生物篩選來源，對(duì)獲得的有益菌進(jìn)行種屬鑒定，以提高山茱萸的利用價(jià)值，獲得有益菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山茱萸：河南省西峽縣山茱萸種植基地。采集后放保鮮袋帶回以保持新鮮，當(dāng)天進(jìn)行試驗(yàn)，未用完材料用保鮮膜包裹并置于4℃冰箱，延長(zhǎng)保存時(shí)間。

大腸桿菌（Escherichia coil）CVCC8099：購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所；黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）：由河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院保藏；所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱、TH2-C恒溫?fù)u床：太倉市科教器材廠；VITZK-z全自動(dòng)微生物分析儀：波舜宇儀器有限責(zé)任公司；3730XL測(cè)序儀、2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FRP980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)：賽齊（上海）生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山茱萸中菌種的分離與純化

取新鮮山茱萸的枝、莖、葉和果實(shí)，流水沖洗塵土后，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無菌水沖洗，將枝、莖截成1～2 cm長(zhǎng)，葉、果半徑為0.5～1.0cm，分為A、B組：將A組材料移至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，空白對(duì)照加無菌水，于37℃恒溫培養(yǎng)1～2d；將B組材料移至PDA培養(yǎng)基上，空白對(duì)照加無菌水，于28℃恒溫培養(yǎng)4～6 d。對(duì)生長(zhǎng)的菌株按菌落形態(tài)進(jìn)行分離、純化、保種。

1.3.2 山茱萸有益菌的篩選

抗大腸桿菌（Escherichia coli）菌株的分離：采用平板對(duì)峙法，將菌體濃度為4×107CFU/mL的大腸桿菌液均勻涂布到培養(yǎng)基上，然后在平板上接種純化的分離菌，37℃培養(yǎng)3～4 d，逐日觀察2種菌的生長(zhǎng)狀況和對(duì)峙抑制效果，拍照記錄。

抗黑曲霉（Aspergillusniger）、黃曲霉（Aspergillusflavus）菌株的分離：在PDA培養(yǎng)基中央分別接種黑曲霉、黃曲霉為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組除在中央接種黃曲霉、黃曲霉外，還在距中央20～25 mm處用直徑為5 mm的打孔器打4個(gè)孔，構(gòu)成正方形，取培養(yǎng)3 d的菌懸液注入孔中，28℃培養(yǎng)3～4 d，逐日觀察對(duì)照和實(shí)驗(yàn)平板真菌生長(zhǎng)狀況，以對(duì)照組菌落直徑與實(shí)驗(yàn)組菌落直徑差作為抑菌性大小，拍照記錄。

1.3.3 山茱萸有益菌的分子生物學(xué)鑒定

將有抗性的菌株送上海生工生物公司進(jìn)行分子生物學(xué)種屬鑒定。細(xì)菌基因組DNA提取按SK8255試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。16S rDNA測(cè)序采用通用引物，上引物為7F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），下引物為1540R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；真菌基因組DNA采用SK8259試劑盒提取，18S rDNA測(cè)序采用通用引物，上引物為NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′），下引物為NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）。

25μL擴(kuò)增體系：2.5μL的10×buffer（含MgCl2），各0.5μL的10 μmol/L的上下引物，1 μL的2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyibonucle oside triphosphate，dNTP），0.2 μL的TaqDNA聚合酶，0.5 μL的20～50 ng/μL基因組DNA模板量，加無菌水至25μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4min，94℃變性45 s，55℃褪火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后最終72℃保持10 min。獲得的16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比對(duì)，18S rDNA的序列在NCBI上采用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)，以進(jìn)化樹同源性比例顯示種屬類型。

1.3.4 山茱萸抗性菌的生理生化鑒定

將獲得的有益菌株用VITZK-z全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行生理生化測(cè)定，以了解菌株的生物學(xué)特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸中菌種的分離與純化

自山茱萸中共分離菌株28株（12株細(xì)菌，16株真菌）。其中，莖中獲得14株、枝中獲得8株、葉中獲得4株、果實(shí)中獲得2株。菌株分布情況表現(xiàn)為自植株形態(tài)學(xué)的下端向形態(tài)學(xué)的上端呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì)。

2.2 有益菌的抑菌性

通過抗大腸桿菌、抗黑曲霉、抗黃曲霉的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，自純化的山茱萸中獲得2株抗性菌，分別編號(hào)為S138、S136，其抑菌圈直徑和抑菌效果分別見表1。

經(jīng)過純化的有益菌S138和S136見圖1。由圖1可知，S138菌落呈白色，大、不規(guī)則，邊緣呈鋸齒狀，菌落扁平、表面干澀，邊緣呈褶皺樣。S136菌落呈淡黃色、半透明，菌落直徑約0.5～1.0 cm，表面隆起、濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊。

2.3 山茱萸抗性菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株S136和S138進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，擴(kuò)增的S136、S138菌株16S rDNA序列條帶明亮，無明顯的拖帶現(xiàn)象，證明分離的序列大小穩(wěn)定，大致在1 500 bp左右，經(jīng)測(cè)序獲得S138和S136的rDNA序列分別為1 472 bp、1 499 bp，結(jié)果見圖3和圖4，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，獲得該菌株的種屬分類。

S138的rDNA片段大小為1 472 bp，測(cè)序結(jié)果見圖3。S136的rDNA片段大小為1 499 bp，測(cè)序結(jié)果見圖4。

由圖3可知，經(jīng)比對(duì)，S138與細(xì)菌界、厚壁菌門、芽孢桿菌綱、桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬的細(xì)菌同源性為100%。

由圖4可知，經(jīng)比對(duì)，S136與細(xì)菌界、變形菌門、變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、腸桿菌屬的細(xì)菌同源性約為98%。

2.4 山茱萸抗性菌生理生化結(jié)果分析

將2株有益菌經(jīng)VITZK-z全自動(dòng)微生物分析儀的檢測(cè)，S138菌株采用BCL卡（革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡），S136菌株采用GN卡檢測(cè)2株有益菌的生理生化反應(yīng)特性，結(jié)果分別見表2、表3。

根據(jù)2株有益菌的生理生化特性，與分析儀內(nèi)貯藏信息比對(duì)，鑒定結(jié)果同分子生物學(xué)鑒定一致，上述大量的生理生化分析數(shù)據(jù)為S138、S136菌株的應(yīng)用提供了完整的信息。

2.5 討論

本試驗(yàn)共獲得2株對(duì)黑曲霉、黃曲霉有明顯抗性的細(xì)菌。這對(duì)于生物防治真菌、特別是生物方法防治糧食中霉變菌的污染具有重要的意義[10]。有益菌不僅能減少化學(xué)防腐劑的毒性，而且長(zhǎng)期使用也不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定的威脅，還對(duì)人類的健康有益[11-12]。從安全、健康、環(huán)保的多角度來說，對(duì)于抵抗黑曲霉、黃曲霉等常見霉變菌菌株的開發(fā)研究可以為食品防腐、糧食防霉提供新的思路、尋求新的方法[13]。

目前菌物的許多序列系統(tǒng)發(fā)育研究都集中在核編碼的核糖體基因上，包括較大的重復(fù)數(shù)量、不平常的堿基比率，以及DNA引物較早的出現(xiàn)，rDNA基因不同區(qū)域的進(jìn)化速率顯著不同，使得其能夠在確定菌株分類地位中得到應(yīng)用[14]。各種精密儀器高通量的檢測(cè)也對(duì)實(shí)驗(yàn)起到了很大的幫助，全自動(dòng)微生物分析儀能夠在24 h內(nèi)得到47個(gè)生理生化反應(yīng)特性的結(jié)果，大大提高了試驗(yàn)的效率，為試驗(yàn)的下一步研究節(jié)省了大量時(shí)間。

理想有益菌的各種特性很難集中于自然微生物體中，因此，除了在篩選途徑上進(jìn)行深入探索外[15]，有益菌的定向遺傳改造及其活性代謝產(chǎn)物的研究也是未來的方向。

3 結(jié)論

以山茱萸為有益菌的來源，自山茱萸中分離28株菌，其中S138、S136對(duì)黑曲霉、黃曲霉有明顯抑菌效果，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定與生理生化鑒定，確定S136是腸桿菌屬、菌株S138是芽孢桿菌屬的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，山茱萸體外存在有應(yīng)用價(jià)值的抗性菌株，可作為抗性菌的分離資源。

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TANG Yanmin,SUN Sijia,ZHAI Zhengtao,JI Fei
(College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

The aim of this research is to obtain the beneficial microbes fromCornus officinalis,the traditional medical plant in China,and then raise the application value ofC.officinalis.The fungi and bacteria fromC.officinaliswere isolated and purified by potato dextrose agar and nutrition agar, respectively.Then antagonist tests were performed between the obtained microbes and harmful microbes,such asAspergillus niger,Aspergillus flavus,andEscherichia coli.The beneficial microbes were identified by molecular biological identification and physiological and biochemical identification.The results showed that 12 bacterial strains and 16 fungal strains were isolated fromC.officinalis,in which 2 bacterial strains showed certain bacteriostatic effect onA.nigerandA.flavus.After the identification,results showed that strain S136 wasEnterobactersp.,and strain S138 was Bacillussp.

Cornus officinalis;beneficial microbe;isolation and identification;anti-Aspergillus niger;anti-Aspergillus flavus

Q939.9

A

0254-5071（2015）04-0097-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.022

2015-03-09

大學(xué)生挑戰(zhàn)杯比賽項(xiàng)目

唐艷敏（1990-），女，本科生，研究方向?yàn)樗幱弥参锏挠幸婢?/p>