一株冬蟲夏草菌的液態(tài)發(fā)酵條件研究

羅園香，盛嘉俊，葉克難*

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

一株冬蟲夏草菌的液態(tài)發(fā)酵條件研究

羅園香，盛嘉俊，葉克難*

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

以菌絲體干質(zhì)量、胞內(nèi)多糖含量及腺苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了一株冬蟲夏草菌的液態(tài)發(fā)酵條件。確定利用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體、胞內(nèi)多糖及腺苷的最佳條件為裝液量100 mL/500 mL，接種量3%，溫度24℃，培養(yǎng)時(shí)間4 d，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min；試驗(yàn)得菌絲體干質(zhì)量為17.232 g/L；胞內(nèi)多糖含量為78.34 mg/g；腺苷含量為633.7 μg/g。

冬蟲夏草；菌絲體；胞內(nèi)多糖；腺苷

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是中華蟲草菌寄生于蝙蝠蛾幼蟲體后發(fā)育成的真菌子座（謂之“草”）和充滿菌絲的僵死幼蟲（謂之“蟲”）的復(fù)合物，在分類學(xué)上，冬蟲夏草隸屬于真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬[1]。冬蟲夏草化學(xué)成分復(fù)雜，含有蟲草素、核苷類、氨基酸、多肽、多糖類、糖醇、甾醇類、脂肪酸、酯、烷烴、多胺類物質(zhì)等活性成分[2]。具有抗腫瘤[3]、抗衰老[4]、增強(qiáng)心肌耐缺血缺氧能力、抗心率失常[5]，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[6]、免疫力[7]、脂類代謝[8]，鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]等多種藥理功能。

近來(lái)由于生態(tài)環(huán)境的退化和人為的過度采挖，蟲草的產(chǎn)量大幅下降，而且個(gè)體變小，質(zhì)量也有所下降，冬蟲夏草自然資源日益枯竭且價(jià)格昂貴，已不能滿足人們對(duì)蟲草日益增長(zhǎng)的需求[10]。通過人工培養(yǎng)獲得冬蟲夏草，給這一名貴藥材繼續(xù)長(zhǎng)久為人類服務(wù)提供了一條新思路。近來(lái)國(guó)內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)在冬蟲夏草人工培育、人工菌絲體生產(chǎn)、成分、藥理等方面做了大量工作，研究表明，人工蟲草菌絲體與天然冬蟲夏草具有相似的化學(xué)成分[11]、藥理作用和臨床療效[12]，且毒性比天然少，為人工培養(yǎng)蟲草菌絲體代替天然冬蟲夏草提供了科學(xué)依據(jù)。

迄今為止，深層發(fā)酵研究已取得較大進(jìn)展，通過液態(tài)深層培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)菌絲體的快速生產(chǎn)，同時(shí)通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，以提高其生物活性物質(zhì)的含量，便于提取目的組分[13]。此外，還可通過連續(xù)性地大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，消除某些難以控制的環(huán)境因子，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，為深加工提供廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域[14]。因此，深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草具有重要的理論和實(shí)踐意義。實(shí)驗(yàn)對(duì)冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞內(nèi)多糖、腺苷和菌絲體的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為冬蟲夏草的工業(yè)化生產(chǎn)提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）：廣東省微生物菌種保藏中心；標(biāo)準(zhǔn)品腺苷：美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑如無(wú)特殊說明均為分析純。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖2.0%、瓊脂2.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、pH值自然；

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖2.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、pH值自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VB10.08%、pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；ES-15精密鼓風(fēng)烘箱：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；VB800超聲波破碎儀：美國(guó)Sonics公司；745紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將保藏的冬蟲夏草菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），25℃恒溫培養(yǎng)5 d，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

種子液培養(yǎng)：將活化的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，于140 r/min、24℃搖床培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：在500 mL的錐形瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL和250 mL，分別按體積分?jǐn)?shù)2%、3%、4%、5%和6%接種量接入液體種子，選取20℃、22℃、24℃、26℃和28℃5個(gè)溫度，發(fā)酵時(shí)間為3 d、4 d、5 d、6 d和7 d，搖床轉(zhuǎn)速分別為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2 菌絲體干質(zhì)量的測(cè)定

將發(fā)酵液以3 000 r/min離心分離15 min，棄去上清液，用蒸餾水反復(fù)沖洗，重復(fù)離心后，于60℃烘干至質(zhì)量恒定，稱取菌絲體干質(zhì)量。

1.3.3 胞內(nèi)多糖含量的測(cè)定方法

（1）溶液的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取于105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖0.050 0 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

6%苯酚溶液：精密稱取6 g重蒸苯酚，置于100 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容，放入4℃冰箱中冷藏保存，備用。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于15 mL具塞試管中，分別加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸4.5 mL，振蕩搖勻，室溫放置10 min。另取2.0 mL蒸餾水按上述方法操作，作為空白對(duì)照。在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

（3）胞內(nèi)多糖的測(cè)定[15]

精確稱取0.500 g干燥菌絲體于試管中，加入15 mL蒸餾水，超聲破碎10 min之后，置于90℃恒溫水浴鍋中浸提2 h，離心得上清液即為樣品溶液。吸取樣品溶液0.1 mL，置于15 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸4.5 mL，振蕩搖勻，室溫條件下放置10 min。另取蒸餾水0.1 mL同上操作制得空白溶液。于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算出胞內(nèi)多糖含量。

1.3.4 腺苷含量測(cè)定方法

（1）溶液的配制

提取液：無(wú)水甲醇與高純水按體積比1∶1配制成提取液，保存?zhèn)溆谩?/p>

腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置100 mL容量瓶中，加提取液溶解，搖勻，定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）色譜條件[16]

色譜柱Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相水∶甲醇（85∶15），流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器波長(zhǎng)為260 nm。

（3）腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于15 mL具塞試管中，分別加提取液至10.0 mL，搖勻。分別以進(jìn)樣量20 μL進(jìn)樣，記錄峰面積。以腺苷含量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

（4）腺苷含量的測(cè)定

精密稱取冬蟲夏草菌絲體0.250 g，置具塞錐形瓶中，加入提取液10 mL，超聲提取，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后即得樣品溶液。按照1.3.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算出腺苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 裝液量對(duì)菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量的影響

在500 mL的錐形瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL和250 mL，按體積分?jǐn)?shù)4%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 d，結(jié)果見表1。

發(fā)酵液為菌絲體的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而裝液量多少不僅反映了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的多少，也會(huì)直接影響發(fā)酵過程中的通氣量。由表1可知，在裝液量為50～100mL/500mL時(shí)，隨著裝液量的增加，菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量均呈上升趨勢(shì)；當(dāng)裝液量為100 mL/500mL時(shí)，菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量均為最高；在裝液量超過100 mL/500mL時(shí)，菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量均呈下降趨勢(shì)。所以，應(yīng)選擇100 mL/500mL的裝液量。因培養(yǎng)基量少，易導(dǎo)致培養(yǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)缺乏，而培養(yǎng)基裝液量太多，則培養(yǎng)過程中通氣效果不理想，這樣都會(huì)影響菌種生長(zhǎng)繁殖。

2.2 接種量對(duì)菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量的影響在10個(gè)裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每?jī)蓚€(gè)為一組，分別按體積分?jǐn)?shù)2%、3%、4%、5%和6%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 d，結(jié)果見表2。

接種為發(fā)酵過程提供了生長(zhǎng)旺盛生命力強(qiáng)的種子，接種量的大小對(duì)于發(fā)酵周期、產(chǎn)量具有明顯的影響，由表2可知，隨著接種量的增加，所得菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量均呈上升趨勢(shì)，并在3%時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)接種量＞3%時(shí)，所得菌絲體干質(zhì)量呈平緩下降，胞內(nèi)多糖及腺苷含量也相應(yīng)減少，與菌絲體產(chǎn)量呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。所以，最佳接種量應(yīng)選擇3%。

2.3 溫度對(duì)菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入液體種子，選取20℃、22℃、24℃、26℃和28℃5個(gè)溫度，在搖床轉(zhuǎn)速120r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 d，結(jié)果見表3。

在發(fā)酵過程中，穩(wěn)定合適的溫度是保證酶活性的重要因素。由表3可知，冬蟲夏草在20～28℃均能生長(zhǎng)，隨著溫度的升高，菌絲體干質(zhì)量、胞內(nèi)多糖及腺苷含量均呈先上升后下降趨勢(shì)。原因可能是溫度升高，生長(zhǎng)加快，菌絲體出現(xiàn)一定的自溶現(xiàn)象。在24℃時(shí)菌絲體干質(zhì)量、胞內(nèi)多糖及腺苷含量均達(dá)到最大。所以，培養(yǎng)溫度應(yīng)選擇24℃。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100mL/500mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下分別發(fā)酵培養(yǎng)3 d、4 d、5 d、6 d和7 d，結(jié)果見表4。

發(fā)酵周期是確定發(fā)酵終止時(shí)間的最終依據(jù)。從表4可知，菌絲體培養(yǎng)4 d的產(chǎn)量最高，而胞內(nèi)多糖與腺苷含量在5 d時(shí)最大，但與4 d相比，增加不明顯。在發(fā)酵進(jìn)行5 d以后，菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖、腺苷含量均開始下降，這可能與菌絲體自溶過程中分泌的各種酶使胞內(nèi)多糖和腺苷分解有關(guān)。綜合考慮，選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干質(zhì)量及胞內(nèi)多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速分別為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)4 d，結(jié)果見表5。

搖床轉(zhuǎn)速的大小直接影響到發(fā)酵培養(yǎng)液中的溶氧水平，過高或過低都不利于菌絲體的生長(zhǎng)。因此選擇適宜的轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)至關(guān)重要。在上述確定的條件下，研究轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞內(nèi)多糖及腺苷含量的影響。從表5可知，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速有利于蟲草菌絲體及其產(chǎn)物的形成，隨著轉(zhuǎn)速的加快，菌絲體及其產(chǎn)物的含量呈上升趨勢(shì)，但超過140 r/min時(shí)，菌絲體及其產(chǎn)物含量開始下降，原因可能是轉(zhuǎn)速過快，使菌絲體受到損傷。因此，選擇轉(zhuǎn)速為140 r/min。

3 結(jié)論

固體栽培冬蟲夏草周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，易受外界因素的影響。液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體比人工栽培生產(chǎn)子實(shí)體有明顯的優(yōu)越性，在液體培養(yǎng)中，營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，利于菌絲營(yíng)養(yǎng)體充分接觸和吸收，菌絲細(xì)胞能在反應(yīng)器內(nèi)處于最適溫度、pH值、溶氧和碳氮比等條件下生長(zhǎng)繁殖，呼吸作用所產(chǎn)生的代謝廢氣又能及時(shí)排放，因此新陳代謝旺盛，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的菌絲體，而且，發(fā)酵后的菌絲或產(chǎn)物易于分離、提取。因此，選用合適的冬蟲夏草發(fā)酵工藝，在提高菌絲體產(chǎn)量及其各有效成分含量的同時(shí)還可以縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。

本試驗(yàn)通過對(duì)冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞內(nèi)多糖、腺苷和菌絲體的發(fā)酵條件優(yōu)化，初步得出冬蟲夏草在葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基下發(fā)酵的最適條件：裝液量100mL/500 mL、接種量3%、溫度24℃、培養(yǎng)時(shí)間4 d、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。在此條件下，菌絲體干質(zhì)量為17.232 g/L；胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為78.34 mg/g；腺苷產(chǎn)量為633.7 μg/g。

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LUO Yuanxiang,SHENG Jiajun,YE Kenan*
(College of Life Science,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

UsingCordyceps sinensismycelia dry mass,intracellular polysaccharides and adenosine as evaluation indexes,C.sinensisprepared by liquid fermentation with the medium of glucose peptone was investigated.Through investigating the effects of fermentation conditions on their yields,the liquid volume,inoculum,fermentation temperature,time and rotation speed were optimized as 100 ml/500 ml,3%,24℃,4 d and 140 r/min,respectively.Thedryweightofmyceliumwas17.232g/L,thecontentsofintracellularpolysaccharideandadenosinewere78.34mg/gand633.7 μg/g,respectively.

Cordyceps sinensis;mycelium;intracellular polysaccharide;adenosine

Q815

A

0254-5071（2015）04-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.017

2015-03-10

廣東省科技廳2008年粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目資助（粵科計(jì)字[2008]63號(hào)）

羅園香（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。

*通訊作者：葉克難（1964-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。