煙草重要基因篇：8. 煙草P450基因

解敏敏

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草重要基因篇：8. 煙草P450基因

解敏敏

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

細胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases， CYP450）是一個保守的血紅素硫蛋白基因超家族，廣泛存在于各種動植物、真菌和細菌中，在信號傳遞、防御反應(yīng)以及代謝產(chǎn)物合成等多種代謝途徑中起著重要的作用。P450酶系可能是自然界中最具催化作用的生物催化劑，它所催化的反應(yīng)類型廣泛而復(fù)雜。根據(jù)其功能，大體可以分為兩類：一類是參與植物次生物質(zhì)的代謝，如植物激素、信號分子、萜類、防御物質(zhì)等；另一類是代謝外源信號分子或環(huán)境污染物，如農(nóng)藥、環(huán)境毒素、有機染料等［1-3］。

1　 植物P450基因家族及功能

1.1 植物P450基因家族

隨著植物基因組大規(guī)模測序，在越來越多的植物中鑒定到P450。基于蛋白序列的相似性和親緣關(guān)系，將P450歸類為家族和亞家族。同一家族的成員序列相似性＞40%，序列相似性＞55%歸類為一個亞家族［4］。隨著P450家族成員的增多，部分低于40%的蛋白序列遺傳聚類分析中明顯聚在一起，它們也被歸為同一家族。植物P450超家族歸類為10個氏族和127個家族，是目前為止植物中最大的酶家族［5］。

1969年，F(xiàn)rear［6］首次在棉花（Gossypium hirsutum）中發(fā)現(xiàn)P450。目前在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］、水稻（Oryza sativa）［7］、苜蓿（Medicago sativa）［3］等多種植物中都鑒定到P450。其中對擬南芥P450的研究較為廣泛深入，擬南芥基因組中含有286個P450基因，其中273個基因被分類，組成45個P450家族和72個亞家族，245個全長基因有基因組注釋。芯片數(shù)據(jù)分析顯示擬南芥P450基因整體上表達量要比看家基因低，但許多基因的表達還具有組織特異性。如CYP88A3和CYP706A2在葉中的表達高于大部分看家基因，CYP81F4和CYP88A3在根中的表達高于看家基因。其他基因如CYP77A6僅在花中特異表達，CYP708A2僅在根中特異表達，CYP81F4和CYP83B1在營養(yǎng)組織中特異表達。大部分低于看家基因表達的P450基因可能與其功能有關(guān)，許多P450基因參與內(nèi)源信號分子的代謝途徑，很多基因在外界誘導(dǎo)后才表達［8］。

1.2 植物P450基因的功能

植物P450在激素、苯丙烷類、生物堿、萜類、生氰糖苷類等代謝途徑中起著重要的作用。肉桂酸-4-羧化酶（CYP73）是第一個被鑒定的CYP450，參與苯丙素的合成過程［7］。CYP51家族是唯一一個在植物、動物、真菌和細菌等多個物種中都具有同源基因的P450家族，功能較保守，催化甾醇類及其衍生物的生物合成［9-10］。擬南芥CYP85A1、CYP85A2、CYP90A1、CYP90B1基因和水稻CYP90D2基因參與油菜素內(nèi)酯的合成；擬南芥CYP701A3、CYP88A3和CYP88A4參與赤霉素的合成；CYP97C和CYP98A等基因家族參與類胡蘿卜素的代謝合成［7-8］。在苯丙烷代謝途徑中，CYP71、CYP73、CYP75、CYP81、CYP84、CYP93和CYP98等家族在木質(zhì)素中間物、黃酮、類黃酮、呋喃香豆素的合成中發(fā)揮重要作用，主要參與脂肪族、芳香族碳的羥基化反應(yīng)以及芳基轉(zhuǎn)移反應(yīng)、亞甲基二氧橋的生成等［11］。其中，CYP74、CYP78、CYP81、CYP86、CYP94、CYP703、CYP709、CYP711、CYP719和CYP726等家族參與脂肪酸的羥基化、環(huán)氧化以及不飽和脂肪酸的過氧化氫功能基團的裂解。CYP71催化植物羥肟酸的合成，在植物的病原菌和昆蟲抗性中起重要作用［12］。CYP51、CYP71、CYP88、CYP97、CYP701、CYP705、CYP706、CYP707、CYP714、CYP720、CYP725和CYP735等家族還參與許多萜類化合物的生物合成，如赤霉素、脫落酸、類胡蘿卜素及植物防御物質(zhì)等。CYP72、CYP85、CYP90、CYP92、CYP710、CYP724和CYP734等在植物油菜素類固醇激素的合成與鈍化中發(fā)揮重要作用，主要參與C-2、C-3、C-6、C-22和C-23位的羥基化與氧化反應(yīng)［13］。植物自我保護的硫代葡萄糖苷類化合物主要有CYP79和CYP83兩個家族參與［14］。CYP82和CYP83家族在水稻中不存在，但是CYP82家族成員在煙草（Nicotiana tabacum） 、豌豆（Pisum sativum）和大豆（Glycine max）中高度應(yīng)答于外界脅迫；而CYP83家族在擬南芥的生長素動態(tài)平衡及植物發(fā)育過程中起著重要的作用［5］。這些植物P450蛋白功能研究為煙草P450的具體功能研究提供了重要線索。

2　 煙草P450家族及功能

2.1 煙草P450基因家族

為了解煙草中的P450的種類和數(shù)量，我們利用基因組數(shù)據(jù)與生物信息學(xué)手段，對煙草中的P450基因家族進行分析。通過將植物代表性的P450蛋白序列與普通煙草基因組比對和預(yù)測，鑒定了263個可能的煙草P450基因，歸屬于44個基因家族，其中173個基因已經(jīng)找到EST證據(jù)［15］?；跓煵軪ST和基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示［15］，部分P450基因在煙草整個生命周期中持續(xù)高水平的表達，這些基因很可能參與內(nèi)源生理代謝過程［16］，如CYP73A1、CYP73A2、CYP51G1、CYP98A1、CYP82E2、CYP71D2、CYP75B1、CYP90A2和CYP97B1，某些基因的表達具有組織特異性，如CYP72A1和CYP96A2在葉片中持續(xù)高表達；CYP74C2、CYP86A1和CYP96A1等在根中相對高水平表達。還有部分基因在所有組織中表達水平都很低，推測可能與抗性相關(guān)，在特定情況或外界環(huán)境誘導(dǎo)下才表達。

2.2 煙草P450的功能研究

與在擬南芥中鑒定的45個家族［8］和水稻中47個家族相比［12］，煙草中僅有少數(shù)P450基因被報道。在煙草中，細胞色素P450涉及萜類、生物堿類、甾醇類、植物激素和信號分子等的合成和代謝反應(yīng)，有些P450還參與抗除草劑的代謝反應(yīng)等。煙草西柏三烯醇羥化酶（CYP71D16）參與萜類化合物代謝途徑，煙草5-表-馬兜鈴酸-1，3-二羥化酶（CYP71D20v1/v2CYP71D21、CYP73A27/A28和CYP92A5）參與生物堿類合成代謝途徑［13，17］。在本生煙草（Nicotiana benthamiana）中發(fā)現(xiàn)了參與甾醇合成的CYP51家族基因［18］。Wang等鑒定了一個煙草腺毛特異的P450基因，通過反義和正義共抑制方法研究表明，P450可以將腺毛分泌成分西柏三烯一醇轉(zhuǎn)化為西柏三烯二醇，轉(zhuǎn)化煙草植株對蚜蟲的抗性有明顯的提高［19］。煙草中的煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿是由CYP82E家族成員編碼的煙堿-N-去甲基化酶（NND，nicotine N-demethylase）催化介導(dǎo)的［20］，目前已經(jīng)獲得多個催化煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的基因，如CYP82E5v2［21］、CYP82E2［22］、CYP82E10［23］和CYP82E4［20］等。煙草CYP81B2、CYP71A11［24］還可以代謝脲類除草劑。

3　 前景與展望

目前越來越多的細胞色素P450被分離出來，但是只有少數(shù)的基因功能得到鑒定，因此，對P450的功能研究、揭示P450基因的表達和調(diào)控是該領(lǐng)域的研究重點。在煙草中，苯丙烷類和萜類代謝是煙草香氣物質(zhì)形成的重要途徑，生物堿的合成是煙草有害物質(zhì)代謝的重要途徑，因此，煙草P450的研究對于提高煙草品質(zhì)和降低煙草危害有著重要的意義。此外，細胞色素P450在培育多抗性植物、創(chuàng)造植物雄性不育系、降解農(nóng)藥殘留以及生產(chǎn)藥用化合物等方面也顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

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