酵母細胞壁多糖的作用及其成分檢測方法

徐智鵬，胡駿鵬，周小輝

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

酵母細胞壁多糖是一種源于酵母的天然高效免疫增強劑，其主要功能成分為甘露聚糖和β-1，3/1，6葡聚糖（以下稱 β-葡聚糖）。 甘露聚糖是寡糖一種，其相對分子質(zhì)量為2000～20000，主鏈由幾十個甘露糖分子以α-1，6糖苷鍵組成，支鏈由幾個甘露糖通過α-1，2和α-1，3相連。酵母β-葡聚糖不同于植物細胞壁中的β-1，4葡聚糖，作為來源于酵母細胞壁的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，由10～20個單糖組成特異性結(jié)構(gòu)的多糖，主鏈由D-葡聚糖通過β-1，3鍵的方式相結(jié)合，支鏈由β-1，6鍵結(jié)合的多聚糖（周祥等，2013）。

1 酵母細胞壁多糖的作用

1.1 調(diào)節(jié)腸胃環(huán)境 研究發(fā)現(xiàn)，病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌和弧菌等的細胞表面都含有凝集素，其能特異性識別動物腸壁細胞上的“特異性糖類”受體，并與該受體結(jié)合而附著于腸壁上，在腸壁上發(fā)育繁殖，分泌毒素，導致腸道疾病的發(fā)生（劉源等，2007）。酵母細胞壁的功能性成分甘露聚糖與病原菌在腸壁上的受體結(jié)構(gòu)非常相似，并與凝集素有很強的結(jié)合能力。凝集素一旦與甘露聚糖結(jié)合便無法繼續(xù)附著于腸壁上，由于病原菌不能利用甘露聚糖，導致缺乏能量而死亡并排出體外。而有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌等可以以甘露聚糖為能源，甘露聚糖進入消化道后段經(jīng)濃縮才能被動物消化道菌群中的有益菌選擇性發(fā)酵利用， 以有機酸、CH4、CO2、H2的形式釋放或參與代謝，提供能量。因此，在飼料中添加甘露聚糖能阻止病原菌等有害菌的定植而減少其含量，且有助于腸道有益菌的增殖。

1.2 提升免疫力 酵母β-葡聚糖是天然的免疫增強劑，能提高機體的非特異性免疫和特異性免疫功能，具體表現(xiàn)在能夠刺激細胞毒性T細胞、B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞發(fā)揮其功效，同時還能增加抗氧化因子發(fā)揮功效，且可以充當佐劑的作用，與抗生素共同作用能增加其效力。Courie等（2005）用酵母β-葡聚糖替代抗生素添加到豬、雞等畜禽日糧中，顯著提高豬、雞的免疫功能，同時可促進生長，提高飼料轉(zhuǎn)化利用率。楊文鴿等（2006）研究表明，羧甲基β-葡聚糖提高了大黃魚的非特異性免疫功能，具體表現(xiàn)在大黃魚血液中的白細胞數(shù)和吞噬能力上，同時血清中溶菌酶和酚氧化酶活力增加。Selvaraj等（2005）研究表明，對鯉魚進行腹膜內(nèi)注射酵母葡聚糖可顯著提高其免疫能力。Chang等（2000）研究報道，在蝦日糧中添加酵母β-葡聚糖能夠增強血細胞的吞噬活性、細胞黏附力和活性氧的產(chǎn)生。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)自由基清除酶，在抗氧化方面起著積極的作用。在對β-葡聚糖的抗氧化活性研究中表明β-葡聚糖可使試驗鼠血清中的SOD活力增加，且具劑量依賴性（王玥瑋，2012）。酵母β-葡聚糖能明顯增加抗生素的效力，當與抗生素聯(lián)合使用時，其刺激巨噬細胞的作用能夠增強藥物的治療效果。大鼠腹膜炎的試驗證實，單獨使用β-1，3-D-葡聚糖的大鼠有80%的存活率（對照組的存活率為20%），單獨使用抗生素組的存活率為65%，而聯(lián)合使用二者則有100%的存活率（張海波和張彥，2010）。

1.3 吸附霉菌毒素 研究表明，酵母細胞壁多糖功能成分有很多結(jié)合位點，通過氫鍵、離子鍵、疏水作用力以及直接結(jié)合的方式，能夠吸附黃曲霉毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，結(jié)合力呈非直線關(guān)系。與普通的無機霉菌毒素吸附劑單純通過正負電荷吸附不同，細胞壁多糖功能性成分對霉菌毒素的吸附具有針對性，其對玉米赤霉烯酮有超強的結(jié)合力并且不會損失維生素等飼料中的有益成分。Raju和Devegowda（2000）研究表明，細胞壁多糖功能性成分可緩解黃曲霉毒素、T-2毒素和赭曲霉毒素對肉雞生產(chǎn)性能的不利影響。體外試驗研究表明，細胞壁功能性成分對黃曲霉毒素（B1、B2、Gl、G2）、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等霉菌毒素的結(jié)合能力很強，分別為85%、67%和67%；對T-2毒素的結(jié)合率為33%；對赭曲霉素、嘔吐毒素、桔青霉素（citrlnin）和蛇形霉素的結(jié)合率為12%～18%；但對雪腐鐮孢菌烯酮和鐮孢菌酮-X的結(jié)合率僅為8%（姚麗欣，2011）。還有體外試驗表明，酵母甘露寡糖對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素的吸附率分別為95%、77%、59%，但對嘔吐毒素吸附率僅為12%（姚麗欣，2011）。體外模擬試驗發(fā)現(xiàn)10 min內(nèi)可吸附10%的玉米赤霉烯酮（侯然然，2007）。Stefan等（2003）報道了β-1，3-D-葡聚糖衍生物對玉米赤酶烯酮具有較好的吸附效果，最大吸附量可達183 mg/g。Yiannikouris（2004）研究報道，酵母源 β-D-葡聚糖的三維結(jié)構(gòu)特征在吸附霉菌毒素過程中起了關(guān)鍵的作用；利用分子模型定位了玉米赤霉烯酮與β-D-葡聚糖間相互作用的空間構(gòu)造和互作分子位點；并證實霉菌毒素和葡聚糖間的主要交互作用力來源于氫鍵與范德華鍵的堆垛互作。張麗霞（2006）研究表明，采用酶堿法制備的葡聚糖維持了三股螺旋結(jié)構(gòu)，對玉米赤霉烯酮具有較好的吸附效果，最大吸附量可達到2.296 mg/mg葡聚糖。

2 酵母細胞壁多糖功能性成分檢測方法

由于酵母葡聚糖是不溶性多糖，并與甘露聚糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)相互結(jié)合，所以其定量測定難度較大。目前檢測酵母細胞壁中功能性成分主要采用酶法和液相色譜法。

2.1 酶解法 首先在堿性條件下溶解酵母葡聚糖，然后在酸性條件下用葡聚糖酶水解成單糖。將β-1，3/1，6-D 葡聚糖、β-1，3/1，4-D 葡聚糖、β-1，3-葡聚糖在攪拌的條件下，用2N KOH溶解或水解，溶液隨后用1.2 mol/L醋酸鈉調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5，該漿狀溶液用Glucazyme酶在40℃下酶解16 h，稀釋離心，通過GOPOD試劑檢測葡聚糖的含量。連喜軍等（2006）在試驗中將樣品與多糖水解酶混合反應，過濾后與純化后的葡萄糖苷酶反應，采用葡萄糖氧化酶、過氧化物酶試劑分別測定標準葡聚糖和樣品酶解后得到葡萄糖濃度，對照葡聚糖標準品酶解后得到的葡萄糖濃度與標準葡聚糖濃度的關(guān)系，與在相同條件下樣品酶解得到的葡萄糖含量進行比對，求出樣品中β-葡聚糖含量。

2.2 高效液相色譜法 根據(jù)葡萄糖和甘露糖在流動相和液相色譜柱的固定相之間具有不同的分配系數(shù)，將水解后的樣品注入液相色譜，用純水作流動相，糖類分子流出后，經(jīng)示差檢測器檢測，用外標法定量。在β-葡聚糖和甘露寡糖水解時，由于樣品可能存在水解不徹底，以及水解產(chǎn)生的葡萄糖和甘露糖由于高溫造成部分發(fā)生其他副反應，導致檢測結(jié)果比產(chǎn)品中實際含有的β-葡聚糖和甘露寡糖偏低。檢測中可采用葡聚糖對照品對上述水解過程引起的誤差進行修正。陳少峰等（2009）采用高壓水解高效液相色譜法測定酵母葡聚糖中葡聚糖含量，優(yōu)化得到了最佳的水解方式，同時與標準直鏈β-1，3-D-葡聚糖進行相同條件下處理的結(jié)果對照，對測定結(jié)果進行校正，RSD為1.11%，該方法快速簡單，測定結(jié)果準確（陳少峰和望忠福，2009）。

3 小結(jié)

酵母細胞壁多糖的主要作用體現(xiàn)在激發(fā)、增強機體的免疫力，抗病和抗感染力，維護腸道微生物平衡，抑制有害菌繁殖，減少霉菌毒素對動物的影響，而且無毒副作用，無耐藥性，無污染。但對于酵母細胞壁功能成分的定量檢測難度較大。目前，多采用酶解法和高效液相色譜法。其中，高效液相色譜法誤差較小，同時便捷省時。

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