氧化應激與腎臟細胞凋亡

綜述與專論

氧化應激與腎臟細胞凋亡

皇甫冰,高繼萍,楊霞,王裕,宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心；實驗動物與人類疾病動物模型山西重點實驗室，山西 太原030001)

【摘要】氧化應激產生的活性氧(ROS)與細胞凋亡存在密切的關系。ROS可通過激活線粒體、Bcl-2家族、NF-κB及MAPKS家族、Caspase家族等途徑引起細胞凋亡，細胞凋亡在腎臟疾病的發(fā)病過程中起著重要作用。本文就氧化應激在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其誘導細胞凋亡的機制進行了綜述。

【關鍵詞】氧化應激；活性氧；腎細胞；細胞凋亡；

[基金項目]山西省衛(wèi)生廳科技攻關項目(2011080)；山西省實驗動物專項(2012k02)。

[作者簡介]皇甫冰(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向:人類疾病動物模型，E-mail: bhuangfu@hotmail.com。

[通訊作者]宋國華(1973-)，女，博士，主要研究方向：人類疾病動物模型，E-mail: ghsongg@hotmail.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.014

Oxidative stress and renal cell apoptosis

HUANG FU-bing, GAO Ji-ping, YANG Xia, WANG Yu, SONG Guo-hua

(Shanxi Medical University, Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental

Animal Science and Hunman Disease Animal Model,Shanxi Taiyuan 030001，China)

Abstract【】Reactive oxygen species (ROS) resulting from oxidative stress have a close relationship with cell apoptosis. ROS induces cell apoptosis through activating different signaling pathways including mitochondria, Bcl-2, NF-κB, MAPKS and Caspases and so on. Cell apoptosis plays a significant role in the course of kidney diseases. In this paper, the function of oxidative stress in the development and progression of kidney diseases and apoptosis mechanism induced by oxidative stress are reviewed.

【Key words】Oxidative stress; Reactive oxygen species, ROS; Renal cell; Apoptosis

腎臟細胞凋亡一直是國內外學者研究的熱點，在多種腎病模型和臨床腎臟病理中均可觀察到細胞調亡，其參與多種腎臟病理損傷的發(fā)生及發(fā)展[1-3]。在腎損傷的初期, 凋亡有利于清除過多的增生細胞而保護腎；而晚期的細胞凋亡加重了腎功能的惡化程度。氧化應激與腎臟細胞凋亡有著密切的關系，氧化應激產生的ROS可通過不同的途徑誘導腎臟細胞凋亡。研究證實氧化應激及其誘導的細胞凋亡是慢性腎功能衰竭(CRF)[4]、腎缺血再灌注損傷(IRI)[5]、急性腎損傷(AKI)[6]、糖尿病腎病(DN)[7]的重要致病因素，在各種腎病的發(fā)病中起重要作用。本文就氧化應激及其誘導腎臟細胞凋亡的機制以及在腎損傷中的作用作一綜述。

1氧化應激的原因和后果

活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)是誘導細胞凋亡的重要因素，是外源性氧化劑或機體內氧化代謝過程產生的性質活潑的含氧化合物的總稱，如超氧化物、過氧化氫、單線態(tài)氧和氫氧根陰離子等。機體在正常情況下會產生少量ROS，在自由基清除酶類和抗氧化劑的作用下能維持氧代謝平衡，對于激活轉錄因子、促進細胞增殖分化、調控某些生理活性物質和炎癥免疫等具有廣泛的生理意義。當細胞受到有害刺激后，ROS大量產生，破壞了機體氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，最終導致氧化應激[8]，促進細胞凋亡甚至導致病理損傷。而研究顯示多種腎病模型均處于氧化應激狀態(tài)，細胞外刺激作用于線粒體導致其功能障礙，從而影響線粒體呼吸鏈中酶的活性，引起氧自由基的增多；線粒體活性氧的產生又可激活許多產生ROS的通路：糖酵解途徑，多元醇途徑(PP)，解偶聯(lián)一氧化氮合酶(NOS)、黃嘌呤氧化酶途徑、NADPH氧化酶和糖基化終產物途徑(AGE)[9-11]。實驗動物模型腎組織內自由基清除劑和抗氧化酶SOD、GSH-Px水平和活性降低，也可能導致ROS水平增多[12]。活性氧通過與細胞內的脂質、核酸、蛋白質發(fā)生反應，導致機體組織脂質過氧化、DNA氧化損害和細胞內蛋白變性，對細胞造成損傷；ROS還可作為細胞內信使，活化許多信號傳導通路如細胞凋亡通路,間接導致細胞損傷[13]，細胞損傷使細胞內產生更多ROS?？梢?，氧化應激是腎臟損傷的重要病生機制，參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

2細胞凋亡與氧化應激損傷

細胞凋亡(apoptosis)又稱為細胞的程序性死亡，是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由凋亡相關基因調控的細胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，在形態(tài)學和生物化學方面有別于細胞壞死。在氧化應激情況下，過多ROS導致細胞損傷，機體在應對 ROS 損害時形成一套復雜的氧化應激應答系統(tǒng)。我們猜想細胞凋亡也是其中一種應答機制，通過清除過多的增生細胞而防止腫瘤的形成，清除受損、危險的細胞而不對周圍細胞產生危害，是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，以減輕細胞發(fā)生的氧化應激損傷。但細胞凋亡是細胞外界環(huán)境因素與細胞自身綜合作用的結果，不僅有特定基因控制, 還受細胞周圍的刺激因素的誘導和抑制, 外源性因子亦可以通過一定的信號通路發(fā)揮刺激作用[14]。在ROS積聚的情況下，除了主動的細胞凋亡外，ROS能通過激活一系列信號通路來誘導細胞凋亡，導致細胞凋亡失調而使得細胞過度凋亡，細胞過度凋亡將會引發(fā)自身免疫疾病和炎癥，與多種急慢性疾病如慢性腎功能衰竭、急性腎損傷等有關[15]。多項研究也表明，無論在正常生理或病理條件下，腎臟細胞均存在著凋亡現(xiàn)象，病理條件下細胞發(fā)生過度凋亡。綜上所述，氧化應激產生的ROS造成細胞損傷，細胞損傷又導致ROS的過量積聚，積聚的ROS誘導細胞過度凋亡，細胞凋亡進一步加劇了氧化應激損傷。

3氧化應激誘導腎臟細胞凋亡的機制

3.1線粒體與腎臟細胞凋亡

內源性和外源性有害刺激都可以改變線粒體的結構和功能，誘發(fā)細胞氧化應激，激活線粒體起始的內源性凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒劑如阿霉素[16]、砷[17]、脂多糖[18]、鎘[19]等都能夠誘導腎臟細胞凋亡，并且其凋亡依賴于線粒體凋亡途徑。de Arriba[20]等以環(huán)孢霉素A(CsA)處理的豬腎小管上皮(LLC-PK1)細胞為實驗對象，進一步探討了線粒體在LLC-PK1細胞凋亡中的作用，實驗發(fā)現(xiàn)CsA破壞線粒體結構，引起線粒體通透性轉化孔(MPTP)的開放、線粒體膜電位的下降、ROS含量增加及促進線粒體的分裂等一系列與細胞凋亡相關事件的發(fā)生。MPTP與細胞凋亡密切相關。MPTP是跨越線粒體外膜和內膜的通道，由內膜蛋白如腺嘌呤核苷酸易位子(ANT)、親環(huán)素D(cyclophilin D)及外膜上的孔蛋白電壓依賴性陰離子通道(VDAC)構成。MPTP周期性開放，以維持線粒體內電化學平衡及穩(wěn)定狀態(tài)。過多ROS通過氧化MPTP的內膜蛋白ANT的相鄰巰基來誘導MPTP的開放，MPTP的不可逆過度開放會導致線粒體跨膜電位(△Ψm)的下降甚至完全崩解[21]。線粒體跨膜電位一旦耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。而MPTP的開放還會導致線粒體內ROS的過度生成及基質的高滲性，導致促凋亡蛋白如細胞色素c(Cyt-c)從線粒體向細胞質釋放，加速細胞的凋亡[22,23]。Zhou[24]用20 μM鎘誘導豬腎小管上皮細胞(LLC-PK1)凋亡的實驗，觀察到伴隨著△Ψm的下降，細胞漿內的細胞色素c明顯增加，能被抗氧化劑NAC有效抑制。Cyt-c的釋放是細胞凋亡的關鍵。Cyt-c從線粒體膜間隙釋放到細胞漿內，在ATP/dATP的協(xié)同作用下，與凋亡蛋白酶活化因子( Apaf-1)及Caspase-9酶原結合而形成凋亡復合體，Caspase-9酶原活化并激活下游的Caspase-3和Caspase-7，最終導致細胞凋亡。最近研究顯示造影劑可誘導腎小管上皮細胞中調控細胞凋亡、增殖的轉錄因子，如FOXO3a、STAT3的活化和失活[25],FOXO3能通過使線粒體呼吸鏈解耦連而促進ROS的產生[26]。綜上所述，線粒體在氧化應激誘導腎臟細胞凋亡中發(fā)揮著關鍵性作用，是細胞凋亡調控的活動中心。

3.2Bcl-2家族與腎臟細胞凋亡

Bcl-2基因家族是介導細胞凋亡的重要因子，在細胞凋亡基因調控過程中起重要調節(jié)作用。Bcl-2和Bax是該家族中最具代表性的抗凋亡因子和促凋亡因子。Bcl-2屬原癌基因，編碼26×103的線粒體膜蛋白，是最重要的凋亡抑制基因，Bax表達水平增加可拮抗Bcl-2的作用,促進細胞凋亡。許多研究發(fā)現(xiàn)ROS可能通過增加Bax/Bcl-2的表達比率來啟動腎臟細胞凋亡[27-29]。Yang等[30]發(fā)現(xiàn)無論在mRNA還是蛋白質水平, Bax/Bcl-2的比值與腎臟細胞凋亡都有密切聯(lián)系。近來，Yang等[31]利用免疫組化和逆轉錄-聚合酶鏈式反應測定80只雄性大鼠的Bax/Bcl-2蛋白質表達和mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn) NaF組、Na2SeO3組均明顯增高，而NaF+Na2SeO3c組顯著降低，提示氟化鈉可通過上調Bax/Bcl-2的比值促使腎臟細胞凋亡，硒通過調節(jié)Bcl-2和Bax的表達來抑制凋亡。因此，Bcl-2和Bax的比值可決定細胞凋亡的敏感性。Bcl-2家族成員主要通過形成同源或異源二聚體來完成對細胞生存和死亡的調控作用。當Bax大量表達時, 形成的大量Bax-Bax同源二聚體會導致線粒體功能的喪失、促凋亡因子從線粒體調控性地釋放和下游caspase的活化，從而誘導和促進細胞凋亡；而Bcl-2的增多會誘導并加劇Bax二聚體的解聚,與Bcl-2形成的異源二聚體Bax-Bcl-2比Bax-Bax更為穩(wěn)定[32]，凋亡被抑制。

Bcl-2基因是目前Bcl-2基因家族中最受關注的基因之一,主要定位于線粒體膜和內質網(wǎng)上[33]。Bcl-2對細胞凋亡的負性調節(jié)機制可能為：1. 線粒體：抑制線粒體內ROS的產生；保護線粒體膜的完整和阻止MPTP的開放，阻斷Cyt-c、AIF的釋放和caspase-9、caspase-3的活化[34，35]；提高線粒體的容許負荷，使線粒體對Ca2+的耐受力增強[36]；2. 內質網(wǎng)：抑制內質網(wǎng)內ROS的產生和Ca2+的外滲[37]；3. 氧化還原機制：上調抗氧化酶活性，提高細胞的谷胱甘肽(GSH)水平，增加細胞總的抗氧化能力[38]；4. 與Bax的作用：阻止Bax向線粒體的遷移和聚集，通過形成異源二聚體抑制Bax的促凋亡作用[39]。Bax通過與線粒體膜上的VDAC結合而促進MPTP開放，誘導凋亡[40](圖1)。Métrailler-Ruchonnet等[41]對高氧誘導小鼠成纖維細胞(L929)凋亡中Bcl-2的保護機制進行了研究，證明過量表達的Bcl-2能夠通過影響線粒體凋亡通路和提高細胞內的抗氧化水平來抑制細胞凋亡。但腎臟細胞有關這方面的研究還較少，Bcl-2對腎臟細胞凋亡的調節(jié)機制有待進一步探討。

3.3NF-κB與腎臟細胞凋亡

NF-κB是細胞內廣泛存在的多向性核轉錄因子，可以將凋亡信號傳遞到細胞核,調控細胞的調亡。Li等[42]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可抑制TLR4/NF-κB p65信號通路，以保護腎小管上皮細胞免受腎缺血再灌注引起的細胞凋亡。Xu[43]用益母草堿處理脂多糖誘導的急性腎損傷大鼠，經(jīng)ELISA和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)脂多糖能夠引起IκBα磷酸化、p65蛋白易位和TNF-α及IL-6表達增加，結果表明益母草堿可以抑制ROS調節(jié)的NF-κB信號通路來發(fā)揮保護作用?？梢奛F-κB信號通路在腎臟細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。NF-κB在正常細胞的胞質中以p50-p65異二聚體的形式與抑制亞基IκB結合處于失活狀態(tài)。Ha等[44]報道,外源性的過氧化氫能夠引起高糖環(huán)境中大鼠腎系膜細胞NF-κB活性的增高,且能被抗氧化劑抑制,提示ROS與NF-κB的活性增高有關?；钚匝跫せ頝F-κB的機制：ROS通過抑制磷酸酶的活性，可以提高蛋白激酶C(PKC)活性，促進IκB磷酸化并被泛素化降解，導致NF-κB與IκB解離而活化[21]；ROS通過共價修飾NF-κB中的組氨酸、半胱氨酸等氨基酸殘基來改變NF-κB的活性[45]。活化的NF-κB暴露出核定位信號并轉位入核，與核內特定靶基因的特異序列(GGGACCTTTCC)相結合后迅速誘導多種基因的表達[46]。鄧超男等[47]用免疫組化和實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測腎組織腎小管上皮細胞中NF-κBp50、NF-κBp65及IκB的表達，p50、p65表達強度隨染氟劑量增加逐漸降低，IκB則呈逐漸增加趨勢，結果表明NF-κB相關基因表達減少引起的腎小管上皮細胞凋亡是慢性氟中毒大鼠腎臟病變的機制之一。近年的研究表明, NF-κB具有抑制細胞凋亡和促細胞凋亡的雙向作用。ROS通過調控NF-κB的活性決定正負性調節(jié)[48,49]：ROS的輕度增加利于NF-κB的激活，抗細胞凋亡；ROS的過度增高阻止NF-κB的激活，促細胞調亡。細胞內的氧化還原水平?jīng)Q定NF-κB的激活和其轉錄功能的發(fā)揮。細胞核內NF-κB的p50亞基能夠與靶基因結合，但當p50被過量的ROS氧化后不能維持還原狀態(tài)，減弱了NF-κB與DNA的結合能力，抗凋亡因子的表達下調，促進了細胞凋亡的發(fā)生[21]。研究顯示活化的NF-κB轉錄凋亡相關基因從而誘導細胞凋亡,Grove[50]和Qin[51]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能激活凋亡基因Fas、c-myc及TNF-α，使基因表達增加從而引起細胞凋亡。近幾年的研究揭示了ROS調節(jié)NF-κB活性的機制,證實NF-κB參與并調控近200種基因轉錄[52],在細胞凋亡中起到了十分重要的作用。

3.4MAPKS家族與腎臟細胞凋亡

MAPKS家族在腎臟細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)家族，包括細胞外信號轉導蛋白激酶(ERKs)、C-Jun氨基末端激酶(JNKs)和p38激酶(p38MAPK)等亞族。許多研究證實絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)介導了多種細胞外刺激導致的腎臟細胞凋亡[53-55]。 Gao[56]等發(fā)現(xiàn)花青素通過抑制ERK通路的活性可減弱順鉑誘導的HK-2細胞凋亡。Guo[57]等研究證實p38MAPK通路參與三聚氰胺誘導的大鼠腎上皮細胞凋亡。激活的MAPK將外界信號傳導到細胞核內,參與細胞的分化、增殖和死亡(壞死或凋亡)等多種生理反應的過程，而大量實驗顯示ROS能夠導致MAPKs(ERK、p38MAPK、JNK)信號通路的激活[55][57-59]。MAPK家族激活的級聯(lián)反應相似,都通過保守的三級酶促反應,MAPKKK→MAPKK(MKK)→MAPK[60]。MKK4和MKK7可激活JNK，MKK3、MKK6以及MKK4 可激活p38，MKK1和MKK2 可激活ERK[61]。郝卯林等[62]通過制作穩(wěn)定高血糖糖尿病模型和波動高血糖糖尿病模型，并用免疫組化法和Western blot檢測腎臟JNK蛋白表達, 發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞胞質JNK蛋白的磷酸化水平均明顯高于正常對照組,且波動高血糖組較持續(xù)高血糖組變化更為明顯, 提示血糖波動可能作為一種刺激信號,會引發(fā)較單純高血糖更加嚴重的氧化應激反應,通過激活JNK,進而促進細胞凋亡。ROS能夠激活凋亡信號調節(jié)激酶1(ASK1)[63,64]。ASK1是JNK和p38通路中的一種MAPK激酶激酶，在生理狀態(tài)下與Trx(硫氧化還原蛋白)結合不具有激酶活性。ASK1主要通過兩種方式調節(jié)MAPKS信號通路，一方面氧化應激導致Trx的二聚化，ASK1與其分離而獲得激酶活性，另一方面ROS直接氧化ASK1而形成同源二聚體，從而獲得激酶活性[23]。活化的ASK1磷酸化激活MAPK，再激活蛋白激酶2與3，進而磷酸化低分子量的熱休克蛋白，最終激活caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。而Jeffrey等[65]在 PHN大鼠膜性腎病模型中發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑加重腎小球足細胞中DNA的損傷，提示ERK活化可能在腎小球足細胞中起到保護細胞的作用。MAPKs成員對氧化應激誘導的細胞凋亡過程中起正性或負性作用還未有定論,對此還存在很多爭議。MAPKs通路在不同腎病模型的發(fā)病機制中發(fā)揮的不同作用仍需進一步研究。

3.5caspase家族與腎臟細胞凋亡

Caspase級聯(lián)反應是多條凋亡通路的匯聚點，調控凋亡的最終執(zhí)行。Caspases是一組存在于細胞質中的具有相似結構的胱冬肽酶，均為半胱氨酸蛋白酶，專一切割蛋白質分子中的Asp-X肽鍵，導致細胞凋亡。ROS與caspase之間存在雙向作用，ROS誘導caspase的級聯(lián)反應，而caspase的激活也可能提升細胞內ROS水平。研究發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡通路中的細胞色素c釋放之后又產生了新的ROS，線粒體膜蛋白和線粒體電子傳遞鏈成分都是caspase的底物[66]。Lu等[67]用對氨基苯胂酸誘導腎上皮細胞凋亡和氧化應激，并用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)活性caspase-3、caspase-9表達增加，結果顯示caspase-3、caspase-9信號通路參與了細胞凋亡。氟化鈉處理的大鼠均有腎臟細胞凋亡，免疫組化檢測均可觀察到中氟組和高氟組中caspase-3、caspase-8、caspase-9的光密度值高于對照組，表明caspase調節(jié)的線粒體通路和死亡受體通路參與了氧化應激誘導的腎臟細胞凋亡[68,69]。胱冬肽酶參與兩條細胞凋亡通路：一條是線粒體通路，由細胞色素c介導，激活caspase-9酶原啟動級聯(lián)反應；另一條是死亡受體通路，F(xiàn)asL蛋白可發(fā)出死亡信號，caspase-8酶原活化啟動級聯(lián)反應。兩條通路均有caspase-3的參與。有研究發(fā)現(xiàn)，定位于內質網(wǎng)的caspase-12的激活獨立于死亡受體、線粒體傳遞的凋亡信號，提示caspase-12可能參與內質網(wǎng)介導的新凋亡[70]。

3.6各機制之間的聯(lián)系

氧化應激誘導細胞凋亡的機制中，線粒體起始的內源途徑、Bcl-2家族的調節(jié)、NF-κB、MAPKS家族及caspase激活等并不是相互排斥的，各機制之間有緊密的聯(lián)系。外界刺激時, MAPKS家族成員JNK、P38MAPK可以將凋亡信號傳遞給線粒體。線粒體接受凋亡信號,釋放細胞色素c,活化特定的caspase蛋白酶, 誘導細胞凋亡。線粒體外膜的透化(MOMP)引起細胞色素c的釋放是一關鍵環(huán)節(jié)，主要受Bcl-2家族蛋白的調控[71]。Bcl-2家族通過促凋亡和抑凋亡因子調節(jié)線粒體介導的凋亡過程,并參與線粒體、死亡受體通路間的串話[72]。Bcl-2又受到JNK的調節(jié)，通過磷酸化Ser-70而抑制其抗凋亡作用[73]。NF-κB可促進Bcl-2 家族中抗凋亡因子的表達，發(fā)揮降低線粒體膜的通透性、抑制細胞色素c釋放的抗凋亡作用[74]。研究表明，NF-κB可通過抑制JNK激活而起到抗細胞凋亡的作用[75]。MAPKs誘導凋亡依賴caspases活性。caspase-3可裂解定位于線粒體的Bcl-2產生的蛋白質分子進而誘導凋亡[72]。線粒體通路、死亡受體通路及內質網(wǎng)通路均有caspase的激活。綜上所述，各機制共同參與細胞凋亡。

4結語

氧化應激產生的大量ROS不僅可直接對細胞造成損傷，也可通過多種不同途徑誘導細胞過度凋亡造成細胞損傷，引起不同程度的腎損傷，氧化應激和腎臟細胞凋亡共同參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。了解氧化腎損傷中的細胞凋亡機制對今后腎病的預防和治療工作、開發(fā)和利用抗氧化活性物質具有重要意義，減少ROS的產生、提高腎臟的抗氧化能力及阻斷ROS 產生，可能是預防和治療腎病的有效途徑。

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〔修回日期〕2014-11-16