小鼠局灶性腦中風(fēng)模型研究進(jìn)展

綜述與專(zhuān)論

小鼠局灶性腦中風(fēng)模型研究進(jìn)展

閆峰1，左瑋2，羅玉敏1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京100052； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京100050)

【摘要】中風(fēng)是包括大腦缺血性中風(fēng)，大腦出血性中風(fēng)(ICH)和蛛網(wǎng)膜下腔出血性中風(fēng)(SAH)在內(nèi)的一類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病率和死亡率居高不下。制作方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好的動(dòng)物模型是研究中風(fēng)損傷發(fā)病機(jī)制和治療方法不可或缺的載體，損傷位置、體積、神經(jīng)功能缺損和腦血流量變化，都可以用來(lái)評(píng)估模型對(duì)于各種治療方法的潛力。本文將對(duì)小鼠的缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)模型的制作方法和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)同時(shí)介紹幾種小鼠中風(fēng)模型的評(píng)價(jià)方法。

【關(guān)鍵詞】小鼠； 腦出血； 腦缺血

[作者簡(jiǎn)介]閆峰(1984-)，男，技師，碩士研究生，研究方向：腦血管病，E-mail： yanfeng@ccmu.edu.cn。

[通訊作者]羅玉敏(1965-)，女，研究員，研究方向：腦血管病，E-mail： yumin111@ccmu.edu.cn。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.013

Research progress of mouse models of focal cerebral stroke

YAN Feng1, ZUO Wei2, LUO Yu-min1

(1. Xuan-Wu Hospital of Capital Medical University, Beijing, 100053, China;

2. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)

Abstract【】Stroke is a class of neurological disorders including cerebral ischemic stroke, cerebral hemorrhagic stroke (ICH) and subarachnoid hemorrhagic stroke (SAH), which has a high incidence of morbidity and mortality. Simple and reproducible animal model is indispensable for the study of pathogenesis and treatment after stroke insult. Location and size of injury, neurological deficits and cerebral blood flow changes can be used to assess the availability of the model for various treatment methods. Construction methods, designing experience as well as the methods of model assessment were summarized in this article.

【Key words】Mouse; Model; Hemorrhagic stroke; Ischemic stroke; Cerebral stroke

中風(fēng)具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，是目前人類(lèi)死亡的三大主要疾病之一，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。近年來(lái)隨著基因工程的發(fā)展，各種人造的基因缺失或者過(guò)表達(dá)的小鼠品系的出現(xiàn)為中風(fēng)的研究帶來(lái)了廣闊的前景。腦中風(fēng)模型的應(yīng)用也逐漸由大鼠模型向小鼠中風(fēng)模型發(fā)展，利用小鼠中風(fēng)模型進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)取得了巨大的成功[2-3]。本文將對(duì)小鼠的缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)模型的制作及評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述。

1小鼠缺血性中風(fēng)模型的制作

1.1顳肌下開(kāi)顱大腦中動(dòng)脈閉塞(dMCAO)模型

Tamura等[4]首次提出并建立一種開(kāi)顱電凝的MCAO模型，經(jīng)典方法為：小鼠麻醉后側(cè)臥，去除其一側(cè)眼與耳之間的被毛，剪開(kāi)皮膚約0.8 cm，暴露顳肌，將顳肌從顱骨上分離，暴露顱骨后用電鉆鉆開(kāi)顱骨，暴露大腦皮層供血?jiǎng)用}，分離近端動(dòng)脈，用電凝或10-0手術(shù)絲線結(jié)扎大腦中動(dòng)脈 (MCA)，造成腦梗死。在模型的制作過(guò)程中如果條件允許應(yīng)對(duì)股動(dòng)脈進(jìn)行分離并插管，定時(shí)采集動(dòng)脈血液對(duì)血?dú)?pO2, pCO2, pH等.)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，使動(dòng)物在正常的生理狀況下進(jìn)行手術(shù)。同時(shí)使用激光多普勒腦血流儀監(jiān)測(cè)腦血流的變化情況，判斷腦血流是否下降到預(yù)期值。此方法制作的缺血中風(fēng)模型一般不可再灌，不適用于對(duì)再灌注損傷的研究。

Tamura-型永久性近端MCAO模型梗死體積取決于動(dòng)物的種系，缺血時(shí)間以及動(dòng)物處死的時(shí)間，如果在嗅束水平以上迅速進(jìn)行MCAO，紋狀體動(dòng)脈通常不會(huì)受累，如果在次級(jí)腦動(dòng)脈水平進(jìn)行MCAO，則梗死體積相對(duì)較小，但是如果同側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈永久閉塞且對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈夾閉1 h，則會(huì)增大梗死體積。

Tamura型MCAO的眾多優(yōu)點(diǎn)之一是可以通過(guò)部分顱骨切除來(lái)檢測(cè)到MCA區(qū)域血管的異常，還可以在缺血區(qū)給大腦減壓。因此這個(gè)模型腦水腫的體積比線栓模型要低。大腦水腫可以使用腦內(nèi)部的壓力(ICP)升高，并導(dǎo)致腦內(nèi)毛細(xì)血管灌注下降，從而進(jìn)一步提高缺血損傷的體積。小鼠的Tamura模型的整體的特點(diǎn)為術(shù)后死亡率低 (0% 到 1%) 和重復(fù)性高[5]。術(shù)后小鼠可能表現(xiàn)出攝食困難，這可能是由于部分顱骨切除時(shí)造成的顳肌以及下顎骨損傷造成的，表現(xiàn)為術(shù)后體重下降，如果進(jìn)行長(zhǎng)期研究需要關(guān)注動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)情況，以免造成不必要的死亡。

1.2線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型

Koizum等[6]在1986年首次提出并建立線栓法MCAO模型首先建立, 隨后 Zea Longa等[7]一些列學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步推廣及改進(jìn)，使其逐漸廣為接受和使用。雖然Zea Longa等使用的是大鼠，但其手術(shù)方法也同樣適用于小鼠模型的制作，只是對(duì)于手術(shù)者的要求要高很多。其經(jīng)典術(shù)式為：將動(dòng)物常規(guī)麻醉后仰臥固定，頸部正中切口，分離頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和 頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎 ECA后，臨時(shí)阻斷CCA和ICA，將ECA結(jié)扎處近心端剪斷，使ECA游離，使之與ICA成一直線。對(duì)尼龍線進(jìn)行包被，包被材料可以使用硅膠或者多聚賴(lài)氨酸。將包被好的線栓從ECA切口處經(jīng)過(guò)ICA進(jìn)入顱內(nèi)區(qū)域，行進(jìn)約8-9mm略感阻力，提示線栓頭部到達(dá)大腦前動(dòng)脈(ACA)區(qū)域，從而阻斷MCA供血區(qū)的血流。如果在缺血后將線栓留動(dòng)脈血管內(nèi)不再拔出，則是永久性缺血模型；如果在缺血一段時(shí)間后將動(dòng)脈內(nèi)的線栓完全拔出則為缺血再灌注模型。動(dòng)物的年齡、體重、品系以及線栓的粗細(xì)、材質(zhì)都嚴(yán)重影響著模型的成功率。作為實(shí)驗(yàn)室模型可重復(fù)性的一部分，配合小鼠動(dòng)脈血管直徑選擇包被不同圖層厚度的線栓更是十分重要的。雖然現(xiàn)在小鼠線栓已經(jīng)商品化，但仍有不少實(shí)驗(yàn)室使用自制的線栓也取得了很好的穩(wěn)定性。如果條件允許所有的短暫性腦缺血實(shí)驗(yàn)都要通過(guò)激光多普勒血流儀來(lái)監(jiān)測(cè)皮層局部腦血流量(rCBF)的變化，以確認(rèn)在插入線栓時(shí)腦血流下降到預(yù)期數(shù)值，拔出線栓后血流恢復(fù)，能夠在MCA區(qū)域重新建立腦血流。

小鼠的手術(shù)過(guò)程較大鼠操作困難，線栓的位置在不足1 mm的空間內(nèi)即可影響模型的最終結(jié)果，故要特別注意插入線栓的深度和手感。首先線栓的頭部要避免進(jìn)入翼顎動(dòng)脈(PPA)殘端，可以在盡可能靠近ICA的地方用10-0單絲尼龍線結(jié)扎翼顎動(dòng)脈。線栓的圖層材料過(guò)厚會(huì)阻礙線栓進(jìn)入ICA的顱內(nèi)部分或者移動(dòng)過(guò)后海馬動(dòng)脈。這種情況下，如果線栓停留超過(guò)24 h，可能會(huì)導(dǎo)致后海馬上部的損傷，故應(yīng)選擇合適的線栓進(jìn)行模型制作。

術(shù)后對(duì)模型的評(píng)價(jià)也極為重要，梗塞大腦一側(cè)半球會(huì)影響對(duì)側(cè)肢體的活動(dòng)。因此，如果在皮層右側(cè)以及尾狀核誘導(dǎo)損傷，則小鼠左側(cè)前肢和后肢會(huì)變?nèi)?。輕輕的掐尾巴，動(dòng)物會(huì)試圖逃離，小鼠會(huì)逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)圈。如果動(dòng)物從麻醉狀態(tài)清醒過(guò)來(lái)，順時(shí)針轉(zhuǎn)圈而手術(shù)是針對(duì)右側(cè)大腦，則有可能是形成了血腫。這些觀察結(jié)果加上局部腦血流量讀數(shù)的變化可以驗(yàn)證模型是否成功。線栓模型的優(yōu)勢(shì)在于其利用了血管內(nèi)介入技術(shù)進(jìn)行MCA阻斷，而不需要進(jìn)行部分顱骨切除。目前普遍認(rèn)為，線栓阻斷MCA區(qū)供血的方法不開(kāi)顱、創(chuàng)傷面小，對(duì)動(dòng)物體溫、血壓、血?dú)庖约叭毖獡p傷引起的水腫和顱內(nèi)壓增高無(wú)明顯影響，因此優(yōu)于開(kāi)顱法。此外由于線栓MCAO法再灌注十分方便，因此在研究腦缺血再灌注損傷中被廣泛應(yīng)用[8-10]。這個(gè)模型的缺點(diǎn)是腦水腫的發(fā)生率、技術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率稍高。

1.3栓塞法和血栓法MCAO模型

栓塞法和血栓法制作小鼠MCAO模型原理與線栓法基本相同，均是使用物理手段將MCA阻斷以達(dá)到使之供血部位缺血的目的，這其中模型成功與否的關(guān)鍵因素是栓子的制備。栓子的制備材料有很多，如空氣，碳素顆粒、石蠟以及自體血栓等等，其中自體血栓制備的血塊最普遍[11-15]。但栓塞法最大的缺點(diǎn)是栓子制備及注入過(guò)程中的隨機(jī)性，無(wú)法預(yù)測(cè)栓塞的部位和大小。

栓塞法模型制作時(shí)除用于堵塞血管的物質(zhì)外，手術(shù)方法可參見(jiàn)線栓法模型，在ECA上剪以斜行的小口后，插入內(nèi)裝制備好的自體血栓的導(dǎo)管，將導(dǎo)管經(jīng)ICA插至顱腦底部，隨后將血栓順著導(dǎo)管的走向注入，即可實(shí)現(xiàn)MCA供血區(qū)的缺血損傷。Traystman等[16]采用自體血制備的血栓栓子纖維蛋白可用來(lái)制作大鼠MCAO模型。血栓制作過(guò)程為：將動(dòng)物麻醉后從股動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血液至內(nèi)徑為0.2 mm的導(dǎo)管內(nèi)，導(dǎo)管兩端連接充滿生理鹽水的注射器輪流向?qū)Ч芗訅海寡涸趯?dǎo)管內(nèi)移動(dòng)凝固，但并不粘附在導(dǎo)管上，后將導(dǎo)管置于37攝氏度的水浴鍋中2 h，后移入4攝氏度冰箱中22 h，使用前將血栓表面紅細(xì)胞洗去置于生理鹽水中備用即可。為了更精準(zhǔn)的保證高血栓塊安置的位置，Dinapoli等[17]在多普勒成像技術(shù)的指導(dǎo)下借助顯微導(dǎo)管輸送栓子進(jìn)入MCA特定部位，成功的建立更為均一的梗死灶。此類(lèi)模型的優(yōu)點(diǎn)是：(1)較接近于人類(lèi)大腦栓塞；( 2)可測(cè)試溶栓藥物的作用。缺點(diǎn)：(1)缺血范圍和部位難以預(yù)見(jiàn)，再灌過(guò)程難以建立；(2)術(shù)中污染誘發(fā)感染等炎性反應(yīng)；(3)嚴(yán)重影響側(cè)支循環(huán), 神經(jīng)功能評(píng)分等分析較差；(3)適用范圍窄，僅適用于一些特殊的研究如溶栓治療等。

1.4誘導(dǎo)蛛網(wǎng)膜下腔出血的線栓模型

制作蛛網(wǎng)膜下腔出血線栓模型(SAH)，使用6-0或者7-0尼龍栓線閉塞Willis環(huán)并插入大腦前動(dòng)脈，此過(guò)程與MCAO模型的制作方法相同。當(dāng)線栓前進(jìn)受到阻力時(shí)，再繼續(xù)插入1 mm以確保動(dòng)脈穿孔，栓線頭部刺穿動(dòng)脈后立即拔出進(jìn)行再灌。如果在制作出血模型的過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)腦血流可以發(fā)現(xiàn)刺破血管后腦血流出現(xiàn)階梯狀下降的特征圖形。

1.5通過(guò)注射膠原酶誘導(dǎo)出血性中風(fēng)模型

血管壁的主要構(gòu)成成分有蛋白聚糖和多種類(lèi)型的膠原。膠原酶可被分為I～VIII型，是一類(lèi)特殊的金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)能夠降解細(xì)胞外間質(zhì)以及基底膜中的膠原。IV型和VII型膠原酶廣泛用于制備動(dòng)物的腦出血模型。膠原酶注入20min后即可通過(guò)降解腦血管基底膜上的膠原蛋白造成血管壁的損傷，導(dǎo)致滲血現(xiàn)象的發(fā)生， 4小時(shí)左右即發(fā)展為片狀出血。膠原酶使用的劑量決定了出血區(qū)面積的大小。

其手術(shù)具體方法為常規(guī)麻醉后將小鼠俯臥，頭頂備皮后在正中做1 cm切口，暴露小鼠顱骨，將小鼠固定于立體定位儀上，確定其前囟中點(diǎn)，以前囟為0點(diǎn)，向前0.7 mm，向右2 mm處為尾狀核于顱骨投影處，用32G針頭的1 μL微量注射器刺破入顱骨4～5 mm，將計(jì)算好劑量的膠原酶(0.15 U/μL)生理鹽水溶液0.5 μL緩慢注入即可，注射時(shí)間應(yīng)大于20 min[18]。膠原酶自身就具有一定的毒性，導(dǎo)致大腦出血區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，此外出血區(qū)周?chē)乃[部位可觀察到炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。該模型屬于滲出性模型，血腫程度較均一，神經(jīng)功能缺陷較明顯，成為腦出血研究中廣泛應(yīng)用動(dòng)物模型之一。

2中風(fēng)的行為學(xué)評(píng)估

在臨床上，習(xí)慣將中風(fēng)患者的神經(jīng)功能損傷大致分為一般功能損傷和局灶性功能損傷。前者反應(yīng)的是患者生命狀態(tài)和整體神經(jīng)功能，后者反應(yīng)損傷造成的定位性功能缺陷，本文將介紹3種國(guó)內(nèi)外常用的中風(fēng)后小鼠的行為學(xué)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)。分別為Bederson小鼠行為學(xué)評(píng)分[19]，Clakr 評(píng)分小鼠一般功能損傷評(píng)分和Clark評(píng)分小鼠局灶功能損傷評(píng)分[20]。需要注意的是：嚴(yán)重行為缺陷的小鼠容易出現(xiàn)嚴(yán)重的低溫，因此需要持續(xù)維持恒溫的環(huán)境。低溫對(duì)短暫性缺血的影響要明顯大于對(duì)永久性缺血的影響，另外和大鼠不一樣，前臂肢體屈曲不是一個(gè)可靠的小鼠行為學(xué)跡象，因此不包括在數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)中。

以上介紹的3中評(píng)價(jià)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，Bederson評(píng)分方法因其簡(jiǎn)單實(shí)用，評(píng)價(jià)準(zhǔn)確而在國(guó)內(nèi)被廣泛應(yīng)用；Clark評(píng)分對(duì)多項(xiàng)神經(jīng)功能進(jìn)行了較為全面的評(píng)價(jià)，操作性好，對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)更具體。

3總結(jié)

在許多種類(lèi)的動(dòng)物中都可以成功的重復(fù)中風(fēng)模型：松鼠猴，沙鼠，兔，貓和狗。作為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，動(dòng)物物種越大，缺血損傷的大小和定位的差異性越大。如豐富的大腦側(cè)支循環(huán)使得狗很難用于中風(fēng)的研究，需要夾閉很多動(dòng)脈分支才能很好的復(fù)制腦缺血損傷的模型。小動(dòng)物比如小鼠和大鼠，則更容易操作，經(jīng)濟(jì)性更好而且隨時(shí)可以得到。另外, 采用廉價(jià)、血管解剖近似于人的小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象還有其他優(yōu)勢(shì), 例如腦組織小生化、組化檢測(cè)費(fèi)用低, 節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材等。小鼠的腦中風(fēng)模型為系統(tǒng)研究中風(fēng)的病理生理?yè)p傷及各種治療干預(yù)提供了一個(gè)重現(xiàn)性好、可控的研究載體。

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〔修回日期〕2014-10-27