豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的研究及應(yīng)用

余婉婷 湛 洋 雷昕諾 張 顏 謝小紅 王乃東 鄧治邦 王愛兵 楊 毅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長(zhǎng)沙 410128)

豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的研究及應(yīng)用

余婉婷 湛 洋 雷昕諾 張 顏 謝小紅 王乃東 鄧治邦 王愛兵 楊 毅*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長(zhǎng)沙 410128)

自20世紀(jì)90年代中期起，豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的豬圓環(huán)病毒病在全球范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)，給世界各國(guó)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境災(zāi)難。2013年，英國(guó)皇家獸醫(yī)學(xué)院Alarcon，P等對(duì)PCV2給英國(guó)養(yǎng)豬業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失進(jìn)行了科學(xué)的統(tǒng)計(jì)，研究結(jié)果表明，2008年P(guān)CV2造成5.23千萬(wàn)英鎊的損失，而在PCV2流行期所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)8.8千萬(wàn)英鎊[1]。我國(guó)生豬出欄量居世界第一，占據(jù)世界約50%的產(chǎn)量。但是，豬圓環(huán)病毒對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的影響也相當(dāng)巨大，造成每年至少數(shù)百億人民幣的直接經(jīng)濟(jì)損失。2013年初，上海黃浦江上出現(xiàn)大量的死豬，官方報(bào)道，豬圓環(huán)病毒是唯一檢測(cè)出的病原體。豬圓環(huán)病毒不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且影響我國(guó)的食品安全、環(huán)境保護(hù)和大眾身心健康等。相關(guān)研究結(jié)果表明，PCV2的核衣殼蛋白質(zhì)（Capsid）能在大腸桿菌中高效表達(dá)，純化的蛋白質(zhì)能在體外組裝成具有細(xì)胞浸染性病毒樣顆粒（VLPs）。通過(guò)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，獲得與野生型病毒大小、免疫原性類似的VLPs。由于VLP在免疫原性與野生型病毒非常相似，且不攜帶病毒的基因組，具有非常高的生物安全性，因此，VLP作為新一代人類和動(dòng)物疫苗具有非常好的開發(fā)前景。

1 豬圓環(huán)病毒的基因分型

豬圓環(huán)病毒是單鏈、環(huán)狀DNA病毒，分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。豬圓環(huán)病毒主要包括兩個(gè)基因型：豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）[2，3]。PCV1最早在20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)作為非致病性的細(xì)胞污染物在豬腎上皮細(xì)胞（PK15）中存在[4]。PCV2則被認(rèn)為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PWMS）及圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）的主要病原體[2]，其基因組含有大約1 766～1 768 個(gè)堿基，編碼兩個(gè)主要的蛋白質(zhì)（Cap和Rep/Rep’）。病毒顆粒平均大小在12～23 nm左右[2]，是目前世界發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一。PCV2分為3個(gè)主要基因亞型：PCV2a，PCV2b和PCV2c。PCV2a和 PCV2b是目前世界主要流行的毒株，而PCV2c僅在丹麥報(bào)道過(guò)。根據(jù)病毒基因組的差異，而PCV2a又可分為：PCV2A、PCV2B、PCV2C、PCV2D、PCV2E，PCV2b又可分為：PCV、PCV、PCV[3]。

1A1B1C

2 PCV2免疫抑制作用的研究進(jìn)展

分子免疫學(xué)研究表明PCV2通過(guò)感染豬的免疫細(xì)胞[5]（主要是樹突狀免疫細(xì)胞，DC），對(duì)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs），又稱天然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞（NIPCs）產(chǎn)生免疫調(diào)控作用，導(dǎo)致NIPCs細(xì)胞受到其他病原體入侵或者CpG寡核苷酸（CpG-ODN）等因子的刺激或誘導(dǎo)后，產(chǎn)生的干擾素-α和腫瘤壞死因子-α的功能喪失，產(chǎn)生免疫沉默，機(jī)體的天然免疫功能喪失[6]。進(jìn)一步的研究表明，PCV2DNA是導(dǎo)致 NIPCs免疫沉默的直接原因[7]，并損害pDCs和單核細(xì)胞來(lái)源的樹突細(xì)胞（DC）肌動(dòng)蛋白的聚合功能及這些細(xì)胞的內(nèi)吞作用[8]。豬圓環(huán)病毒病在臨床上常表現(xiàn)為PCV2與其他病原體的混合型感染[9，10]（如，豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒和豬肺炎支原體等）。因此，一種可能性的病理機(jī)制為：由其他病原體所引起的感染，導(dǎo)致非特異性地免疫激發(fā)，并且有可能通過(guò)改變細(xì)胞免疫（如，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和種類）造成PCV2在豬免疫細(xì)胞中大量的復(fù)制和積累；同時(shí)，PCV2的大量擴(kuò)增進(jìn)一步產(chǎn)生免疫抑制，導(dǎo)致豬對(duì)其他病原體產(chǎn)生更強(qiáng)的易感性[9，11]。由于PCV2和其他病原體之間的相互促進(jìn)作用會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生很強(qiáng)的致病力，因而PMWS綜合征導(dǎo)致豬死亡率非常高，可達(dá)到90%以上[12]。大量的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使很多研究者產(chǎn)生共識(shí)：PCV2所導(dǎo)致的PWMS是一種獲得性免疫缺陷癥[10，13，14]。

目前，正在評(píng)估豬圓環(huán)病毒對(duì)人體細(xì)胞的浸染性及其危害。由于人體疫苗生產(chǎn)過(guò)程中大量使用到動(dòng)物血清和胰蛋白酶，最近，在人輪狀病毒（rotavirus）和脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）的疫苗及生產(chǎn)這些疫苗所使用的細(xì)胞中檢測(cè)出到PCV1和PCV2DNA[15，16]，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，PCV在細(xì)胞中具有浸染和擴(kuò)增的特性，并不斷產(chǎn)生適應(yīng)期宿主細(xì)胞的基因突變[15]。Beach，NM 等研究證明PCV1能浸染人肝臟腫瘤細(xì)胞，并且能有效擴(kuò)增[17]；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明PCV1能浸染人T淋巴細(xì)胞，引起細(xì)胞發(fā)生病變[18]。

3 PCV2入侵細(xì)胞機(jī)制的研究近況

PCV2入侵宿主細(xì)胞主要有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：（1）吸附；（2）入侵。首先，PCV2與宿主細(xì)胞膜表面受體相互作用。到目前為止，并沒(méi)有PCV2的特異性受體的報(bào)道。很多病毒利用黏多醣（GAG）作為細(xì)胞膜上的廣譜性受體，Misinzo G.等報(bào)道PCV2VLPs可通過(guò)與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素（HS）或者硫酸軟骨素B（CS-B）結(jié)合而浸染細(xì)胞[19]。減少以上受體分子在細(xì)胞膜上的分布，將會(huì)明顯抑制PCV2VLPs的浸染。PCV2的細(xì)胞內(nèi)化過(guò)程的分子機(jī)理目前還不是十分清楚，有研究認(rèn)為，PCV2在不同的細(xì)胞系中，使用不同的浸染途徑。例如，在豬的3D4/31 單核細(xì)胞系中，PCV2是通過(guò)Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生浸染[20]。然而，在豬腎上皮細(xì)胞（PK15 cells）中，PCV2也可以通過(guò)Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，但此途徑并不能導(dǎo)致病毒在細(xì)胞中有效復(fù)制，相反抑制Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，可以大幅度提高PCV2浸染PK15細(xì)胞的能力[21]。很明顯，在PK15細(xì)胞系中存在著一種我們未知的PCV2浸染機(jī)制，但以上各種浸染過(guò)程都依賴于絲狀肌動(dòng)蛋白，在培養(yǎng)基中加入actin聚合抑制劑，會(huì)導(dǎo)致PCV2失去浸染能力[20，21]。PCV2浸染樹突狀細(xì)胞后，并不會(huì)立即啟動(dòng)復(fù)制，但其對(duì)細(xì)胞依舊能保持感染力，由此可以推測(cè)PCV2可能是利用一種未知的免疫入侵機(jī)制，逃逸免疫細(xì)胞降解的途徑來(lái)感染其他細(xì)胞，與此同時(shí)，PCV2病毒借助于樹突狀細(xì)胞自身的遷移能力，將其作為自身傳播的載體，在不進(jìn)行自我復(fù)制的情況下完成持續(xù)感染[22]。

盡管近些年已經(jīng)對(duì)PCV2浸染機(jī)理做了初步的研究，但是，PCV2的內(nèi)吞途徑、與細(xì)胞骨架及宿主細(xì)胞的相互作用以及產(chǎn)生免疫的分子機(jī)理仍然不清楚，而這些對(duì)我們從根本上理解PCV2的致病機(jī)理及疫苗的研究與應(yīng)用等都起著十分重要的作用。普通的細(xì)胞培養(yǎng)很難產(chǎn)生高滴度的PCV2，因此，研究都使用到較高濃度的PCV2VLPs代替PCV2來(lái)研究其浸染機(jī)理[19～21]。

4 PCV2 VLPs 國(guó)內(nèi)外研究與開發(fā)的現(xiàn)狀

借助于昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功地表達(dá)PCV2的核衣殼蛋白質(zhì)[23，24]，通過(guò)密度梯度離心后可以獲得高純度的PCV2VLPs。在此基礎(chǔ)上開發(fā)的PCV2VLPs亞單位疫苗，已經(jīng)成為目前國(guó)際市場(chǎng)的主要疫苗種類。其免疫保護(hù)效果非常好，自使用后，PCV2的流行在歐美等地得到迅速控制，產(chǎn)生很好的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。但是，利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)PCV2VLPs疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格高，限制了其大規(guī)模使用。目前我國(guó)還不具備生產(chǎn)能力，并且由于價(jià)格原因（在我國(guó)，調(diào)查顯示PCV2疫苗的價(jià)格是決定養(yǎng)豬業(yè)主是否使用疫苗的首選因素[25]），進(jìn)口疫苗的使用率非常低。如果利用其他表達(dá)系統(tǒng)（如：原核表達(dá)系統(tǒng)等產(chǎn)生PCV2VLPs）將大幅度降低PCV2VLPs的生產(chǎn)成本。很多研究者利用大腸桿菌表達(dá)PCV2的Capsid蛋白質(zhì)，并在體外組裝成，但多數(shù)是以失敗告終[26]，2013年，Yin等將Sumo-標(biāo)簽融合到PCV2Capsid基因5 ’端，能提高Capsid蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)及可溶性，純化后的融合蛋白質(zhì)，通過(guò)酶切去掉Sumo-標(biāo)簽后，PCV2Capsid蛋白質(zhì)能在體外成功地組裝成PCV2VLPs[27]。

5 VLPs研究和開發(fā)的意義

VLPs 的研究和開發(fā)具有十分重要的生物學(xué)意義，是目前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。VLPs具有以下基礎(chǔ)及應(yīng)用價(jià)值：（1）VLPs保留有野生型病毒顆粒的免疫原性，但不含有病毒基因組成分。因此，具有很好的免疫原性和生物安全性；（2）VLPs能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生天然免疫（類似于佐劑）。由于VLPs的顆粒大小一般在20～100 nm，較普通蛋白質(zhì)抗原要大得多，所以它們也能更好地刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫；（3）基于VLPs的二價(jià)和多價(jià)疫苗。由于VLPs是多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，可以通過(guò)基因工程的方法，將其他病原體的中和抗體表位插入到某個(gè)病毒VLPs的非關(guān)鍵區(qū)，從而產(chǎn)生多價(jià)疫苗；（4）可以作為新一代人類和動(dòng)物藥物載體：藥物分子如何跨過(guò)細(xì)胞膜的屏障作用有效地進(jìn)入細(xì)胞，一直以來(lái)是生物醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)問(wèn)題。VLPs具有與野生型病毒類似的細(xì)胞浸染能力，所以，它們能夠有效地?cái)y帶藥物分子、siRNA甚至DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。如，人類子宮頸乳頭瘤狀病毒的VLPs能有效攜帶干擾性RNA分子進(jìn)入到靶細(xì)胞，從而起到有效地治療作用[28]。

6 VLPs的研究和應(yīng)用存在的挑戰(zhàn)

VLPs作為疫苗，與傳統(tǒng)疫苗比較，相關(guān)的設(shè)計(jì)、表達(dá)、組裝及純化等對(duì)技術(shù)條件要求比較高，而且不是所有病毒都能組裝成VLPs。同時(shí)，以VLPs為基礎(chǔ)的二價(jià)或多價(jià)疫苗，需要對(duì)VLP載體本身的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究。例如，以蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，將另外一個(gè)或多個(gè)病原體的中和抗體表位插入到VLP中s，需要保證其插入點(diǎn)不影響VLPs的表達(dá)和組裝，且不影響兩者的免疫原性和細(xì)胞浸染性等。

目前，許多病毒VLPs的表達(dá)都是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者昆蟲細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)，造成生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。還需要解析VLPs的體外組裝、去組裝的分子機(jī)理等來(lái)實(shí)現(xiàn)VLPs作為藥物載體可能性。

7 PCV2VLPs的研究和應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

很多病毒VLPs 的表達(dá)和組裝需要共表達(dá)兩個(gè)或者兩個(gè)以上不同的病毒衣殼蛋白質(zhì)（VP1，VP2等），這樣為VLPs 設(shè)計(jì)和制備提高了難度。而PCV2VLPs僅由一種核衣殼蛋白質(zhì)構(gòu)成，僅需要表達(dá)一種蛋白質(zhì)就能有效地產(chǎn)生VLPs。PCV2Capsid 蛋白質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)已于2011年被解析出來(lái)[29]，為以PCV2VLPs作為載體的二價(jià)及多價(jià)動(dòng)物疫苗提供了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，PCV2以硫酸乙酰肝素（HS）作為廣譜性受體，但目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PCV2的特異性細(xì)胞受體[30]。從其細(xì)胞入侵動(dòng)力學(xué)過(guò)程來(lái)看，很多學(xué)者認(rèn)為PCV2的浸染并不需要特異性受體，因此，它對(duì)大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都具有浸染性。因而，對(duì)PCV2VLPs改造后，可以作為動(dòng)物及人體藥物攜帶的有效載體。

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余婉婷，女，1990年出生，湖南常德人，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)預(yù)防獸醫(yī)碩士生，郵箱：ywt1017806202@163.com

“國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目”(31372406), “國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目”(1014 2R0176)

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