試論HE染色質(zhì)量應(yīng)用的體會

王志生 郭海燕 孫 巖 武 艷*

（吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130012）

試論HE染色質(zhì)量應(yīng)用的體會

王志生 郭海燕 孫 巖 武 艷*

（吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130012）

目的 通過對常規(guī)HE染色方法的改進，提高HE染色質(zhì)量，為臨床病理檢測提供更優(yōu)質(zhì)保證。方法 對常規(guī)HE染色中的試劑配制、無水化處理、封片樹膠配制及分化過程等方面加以改善，觀察對結(jié)腸組織的染色質(zhì)量。結(jié)果 染色質(zhì)量好，結(jié)腸組織整體染色鮮艷，較深，紅藍的對比清晰可見，細胞核染色呈深藍或藍色，染色質(zhì)染色清晰，細胞質(zhì)色呈粉紅或鮮紅色，核仁核模染色清楚可見結(jié)腸組織及外周無明顯蘇木精沉積。結(jié)論 通過對切片HE染色過程技術(shù)的改善，可為臨床病理檢測工作提供切實保障，值得臨床推廣使用。

HE染色；質(zhì)量；應(yīng)用體會；分化

臨床病理檢測已經(jīng)伴隨人們走過一個多世紀，其中HE染色技術(shù)是最常用及最可靠診斷方法，染色穩(wěn)定，操作簡單及色彩鮮艷是其優(yōu)點，但染色效果不夠穩(wěn)定的現(xiàn)象亦時有發(fā)生，因此做好各個環(huán)節(jié)的染色工作尤其重要［1-4］，現(xiàn)本文就如何做好HE染色質(zhì)量的工作，淺談體會，探討如下。

1　材料與方法

1.1材料：標本選擇本院送檢的結(jié)腸組織；蘇木精；梯度乙醇（75%、85%、95%及無水乙醇）；甘油；伊紅，冰醋酸、檸檬酸及碳酸氫鈉，酸性飽和硫酸鋁鉀溶液，酸性乙醇。

1.2試劑配制：①蘇木精配制方法：將5 g蘇木精溶解于50 mL無水乙醇中，將100 g鉀明礬溶解于1000 mL蒸餾水中，加熱沸騰鉀明礬，將溶解好的蘇木精加入其中，再將115 g黃色氧化汞加入其中，共沸2 min后，冷水冷卻，將1 g檸檬酸加入其中，輕輕攪拌，再加入50 mL甘油。每次可配制1000 mL，用時再過濾，用時可持續(xù)11周，染萬張切片［1］。②伊紅染液配制方法：參考文獻［5］。③酸性乙醇溶液配制：將2 mL冰醋酸加入400 mL 95%乙醇中即可。④酸性飽和硫酸鋁鉀溶液配制：將10 mL冰醋酸加入400 mL蒸餾水中，再加入硫酸鋁鉀使其達到飽和。

1.3組織處理。取材：結(jié)腸組織；固定：在10%的中性福爾馬林中固定18～24 h；脫水：用梯度乙醇脫水12 h；透明：在二甲苯中浸泡2 h；浸蠟：浸泡在65 ℃石蠟中3.5 h；包埋：用自動包埋機進行包埋；切片：切片厚度為4 μm。脫蠟：二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化［2］。

1.4染色：①蘇木精染色：將玻片放在飽和硫酸鋁鉀中，震動3次（5 s），用配好的蘇木精進行染色3 min。②伊紅染色：用0.5%的伊紅溶液將切片染色3 min，取出后立即用蒸餾水沖洗2 s，再快速放入85%乙醇中2 s，進行分色，取出晾干，用95%乙醇進行脫水25 s，再用無水乙醇脫水50 s，晾干后再用二甲苯進行透明。

1.5染色質(zhì)量判定：染色質(zhì)量好的判定: 色彩鮮艷，紅藍色分明，蘇木精無沉渣聚集，核漿的對比清楚；反之則為染色質(zhì)量差。

2　結(jié) 果

染色質(zhì)量好，結(jié)腸組織整體染色鮮艷，較深，紅藍的對比清晰可見，細胞核染色呈深藍或藍色，染色質(zhì)染色清晰，細胞質(zhì)色呈粉紅或鮮紅色，結(jié)腸組織及外周無明顯蘇木精沉積，核仁核模染色清楚可見。

3　討 論

HE染色技術(shù)屬于病理學(xué)、組織學(xué)中最常用方法，操作簡單，色彩鮮艷，但是常規(guī)的HE染色方法往往存在以下問題：切片組織的染色質(zhì)量差，不鮮艷，紅藍的對比不清楚，細胞核染色呈淡藍或灰藍色，細胞質(zhì)染色呈淡紅色，核模核仁染色不明顯，核質(zhì)對比不清晰，組織及周圍經(jīng)常會有明顯的蘇木精沉積。因此本院就常規(guī)HE染色方法加以改善，取得良好效果，現(xiàn)將體會總結(jié)如下：

3.1蘇木精配法改善。蘇木精有兩種配制方法：自然氧化法及人工氧化法。蘇木精本身分子中缺少發(fā)色基團，但當(dāng)經(jīng)過氧化時就可成為染料，因此我們常把氧化后的蘇木精稱為蘇木紅，常用自然氧化的蘇木精很難變?yōu)樘K木紅，因此所需時間較長，而人工氧化法可克服這一缺點，其中最常規(guī)配方為Harr's方法，此配方廣泛應(yīng)用原因在于：染色速度快，顏色鮮艷等，但在實際應(yīng)用過程中，常常因蘇木精的過度氧化而引起染色快速消失現(xiàn)象的發(fā)生，有效期明顯縮短。因此本實驗改進蘇木精配置方法，如上述實驗方法中提到，改善后可明顯使染色壽命增長，染色質(zhì)量增強。原因在于改良配方中加入了氧化劑物質(zhì)，將蘇木精分子的兩個苯環(huán)喪失氫原子，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變成醌型苯環(huán)結(jié)構(gòu)，此為發(fā)色基團，其羥基為助色基團，因此適量的氧化劑可使蘇木精在較短時間內(nèi)就可變成蘇木紅，而且亦不會因過度氧化而引起蘇木紅破壞，在使用過程中，蘇木精未氧化部位可自動氧化為蘇木紅，源源不斷的補充被消耗掉的蘇木紅分子，保持染液的穩(wěn)定性持久［3］。

3.2改善伊紅染色。改進前染色方法：切片在晾干后，用梯度酒精進行脫水，相繼浸入75%乙醇及85%乙醇及95%乙醇中脫水25 s，最后再用無水乙醇脫水30～60 s。改進后染色方法如上述實驗部分所述，改進后與改進前比較，胞質(zhì)染色明顯變清晰均勻，而且質(zhì)感很好［4］。

3.3無水化的處理：①蘇木精染液：在以往HE常規(guī)染色中，切片常經(jīng)脫蠟水處理，因此在進入蘇木精染液中時會摻入自來水，且自來水隨時間增加而不斷增多，因蘇木精顯酸性，pH值小于自來水，因此染液的pH值不斷增高，OH-離子會逐漸增多，OH-離子與Al3+反應(yīng)，使游離的Al3+變少，迫使鋁合蘇木紅數(shù)量降低，DNA側(cè)鏈磷酸基團結(jié)合蘇木紅變少，導(dǎo)致細胞核染色變淡，且如果染液pH值大于胞質(zhì)等電點時，細胞質(zhì)中的氨基酸等物質(zhì)會酸化帶負電荷，這時鋁合蘇木紅可與其非特異性地結(jié)合，細胞質(zhì)染色，造成背景顏色過重。除此之外，染液pH值增高使蘇木精氧化過快，且鋁合蘇木紅分子中帶負電荷的羥基可使其自身相互結(jié)合，導(dǎo)致蘇木精聚集導(dǎo)致沉渣生成。蘇木精的高pH值使細胞核與蘇木精的結(jié)合能力降低，與核外親和力增強，出現(xiàn)染色時間過長，玻片及細胞質(zhì)亦染色，且核質(zhì)染色分界線模糊，呈灰色或黑色。無水處理：將切片用酸性飽和硫酸鋁鉀溶液處理片刻，將切片中得水分去除，再將結(jié)腸組織切片浸入蘇木精染液。優(yōu)點：在環(huán)境相似情況下，染液可迅速進入細胞核進行染色； 酸性飽和硫酸鋁鉀溶液與蘇木精染液pH值相似，不會影響蘇木精的染色質(zhì)量，且不斷補充因染色損失的酸性鋁離子。②伊紅染液：pH值對伊紅染液影響較大，因自來水的增多，pH值不斷升高，當(dāng)染液pH值高于胞質(zhì)等電點時，胞質(zhì)因酸式電離導(dǎo)致負電荷產(chǎn)生，同是酸性染料的伊紅與帶負電的胞質(zhì)同性相斥，導(dǎo)致伊紅與細胞質(zhì)結(jié)合能力下降，細胞質(zhì)不能染色或染色較淺，切片的整體效果模糊不清，藍紅不分明，染色質(zhì)量差。因此，本院在切片脫水后先行污水處理再浸入蘇木精染液。無水處理：將切片用酸性乙醇溶液處理片刻，將切片中得水分去除，再將結(jié)腸組織切片浸入伊紅染液中染色。保證伊紅高效快速的染色，其染色質(zhì)量好且穩(wěn)定［5］。

3.4封片樹膠配制改善：封片前可將少量無水碳酸加入到樹膠瓶中，不斷攪拌后放入低溫干燥箱數(shù)日，讓其自然澄清，留取上清液備用，這樣的封片樹膠可防止使用時的黏性過大導(dǎo)致染色質(zhì)量差，封固持久耐用。

3.5分化過程注意事項：分化目的在于細胞核染色適中及胞質(zhì)中沒有背景色產(chǎn)生。在分化過程中首先核周圍物質(zhì)脫色，其次為細胞核脫色，當(dāng)核脫去一部分顏色后，達到適中染色時即可停止分化；水洗返藍，顯微鏡下觀測，要求細胞核形態(tài)清晰可見，且不存在背景色，經(jīng)伊紅染色后呈現(xiàn)核漿藍紅色對比清晰可辨，方便病理檢測。在分化過程中，如發(fā)生分化不過狀況，則細胞核顏色會呈濃藍色，核質(zhì)形態(tài)分辨不清，會發(fā)生淺藍色背景，伊紅染色后呈紅紫色，染色質(zhì)量差，導(dǎo)致觀察困難。如發(fā)生分化過度狀況，細胞核染色呈淺藍色且形態(tài)模糊，病理檢測困難。因此，分化始終尤為重要：①鹽酸酒精濃度: 鹽酸酒精濃度控制在1%之內(nèi)，必要時適當(dāng)降低可將鹽酸酒精濃度，其分化的時間要根據(jù)鹽酸酒精濃度做調(diào)整，隨著鹽酸酒精濃度增加，分化時間隨之降低，反之則分化時間加長；②適當(dāng)分化:在分化過程中要密切觀察，當(dāng)切片顏色由深藍色轉(zhuǎn)為粉紅色時，立即停止分化，將其放入流水中。流水目的：沖掉殘留的鹽酸酒精，快速終止分化［6］。

上述結(jié)果表明，改善后的切片染色質(zhì)量好，結(jié)腸組織整體染色鮮艷，較深，紅藍的對比清晰可見，細胞核染色呈深藍或藍色，染色質(zhì)染色清晰，細胞質(zhì)色呈粉紅或鮮紅色，核仁核模染色清楚可見，結(jié)腸組織及外周無明顯蘇木精沉積?？蔀榕R床病理檢測工作提供切實保障，值得臨床推廣使用。

［1］ 田玉旺，李琳，朱紅艷.常規(guī)HE染色易出現(xiàn)的問題原因及解決方法［J］.診斷病理學(xué)雜志2012，15（6），500-502.

［2］ 劉少顏.介紹一種改良的骨髓石蠟包埋組織網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，1（1）:104.

［3］ 章栽良，顧元忻，鄭曉瑾.冰醋酸在常規(guī)HE制片中的應(yīng)用［J］.診斷病理學(xué)雜志，2011，16（5）:389.

［4］ 王伯沄，李玉松，張遠強.病理學(xué)技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:96-134.

［5］ 仲劍平.醫(yī)療護理操作常規(guī)［M］.4版.北京:北京人民軍醫(yī)出版社，2013:1994-1995.

［6］ 唐從國.關(guān)于病理制片技術(shù)處理失當(dāng)問題的探討［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，9（19）:1503.

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1671-8194（2015）24-0042-02