心臟震波聯(lián)合干細胞治療在心血管領域的運用展望

王靜、周超綜述，郭濤審校

心臟震波聯(lián)合干細胞治療在心血管領域的運用展望

王靜、周超*綜述，郭濤審校

目前心血管疾病在全球疾病負擔中居首位，仍須不斷探索新而有效的治療靶點和方法。干細胞在心血管疾病的應用就是一個既有進展又面臨困難的新興領域。 隨著對干細胞作用機制的不斷探索，旁分泌概念被提出，更加強調了在干細胞治療過程中，核心機制是形成一個有利于干細胞歸巢、激活、增殖、分化的心肌微環(huán)境。心肌基質細胞衍生因子（SDF）、CXC趨化因子受體4（CXCR4）、血管內皮生長因子（VEGF）等可能是這個微環(huán)境中的重要成分。另一方面已證實，心臟震波治療具有促進血管生成等作用，而這些作用的機理正是基于心臟震波治療上調了 SDF、CXCR4、VEGF 的表達。一些初期的實驗研究也證實了心臟震波治療可以促進干細胞在心臟的歸巢和分化。因此心臟震波治療同干細胞聯(lián)合運用于心血管疾病將會是一個極具吸引力的研究方向。

心臟震波治療；干細胞；旁分泌

盡管在心血管領域，近幾十年有了長足的進展，但心血管疾病仍給社會、 經濟造成了龐大的負擔。據(jù)最新的全球疾病負擔報告顯示： 單在 2010 年，全球就有約1 290萬人死于心腦血管疾病，換言之，每4個死亡的人中就有1個死于該病，居全球疾病負擔的首位[1]。因此在全球范圍內，研究者始終致力于尋找針對心血管疾病新而有效的治療靶點及治療方法。而心臟震波治療和干細胞治療都是基于此的探索，也都在基礎研究和初期的臨床試驗中各自取得了不菲成就。在干細胞移植治療中，形成一個有益于移植干細胞和原住心肌干細胞激活、歸巢、增殖、分化的微環(huán)境是干細胞成敗的關鍵之一；同時心臟震波治療可以促進血管生成、抑制心室重構、改善左心室射血分數(shù)、抗炎、抗氧化等作用。這些作用的機制與干細胞微環(huán)境有著密切的關聯(lián)。本文將對兩種技術方法的內在聯(lián)系做一綜述， 以期將來心臟震波聯(lián)合干細胞治療能在心血管領域有更大的進展。

1 干細胞來源

心肌干細胞（Cardiac stem cell，CSC）：在上個世紀，經典理論認為哺乳動物心臟是終末分化器官，心肌細胞在出生以后便失去了自我更新能力，心肌細胞只能變長變大，而不能進行有絲分裂。然而這個理論如今已遭到顛覆[2]。運用14C 標記示蹤法證實，心肌細胞的更新貫穿人的一生。25歲時，每年約有1%的心肌細胞進行了更新；而 75歲時，這個更新率只有0.45%[3]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，在出生以后，成人體內至少有四類細胞能增殖、分化為心肌細胞，為其提供更新：（1）駐扎于心臟干細胞巢內的心肌源性干細胞或心肌祖細胞[4]，此為狹義上的CSC。（2）骨髓源性的CSC或祖細胞[5]。（3）源于胚胎時期的心包臟層細胞[6]。（4）一些特殊成熟心肌細胞本身就可以再次進入細胞周期進行有絲分裂[7]。以上四類可認為是廣義上的CSC。CSC在心臟再生方面是一個較有吸引力的研究方向，因為其從分化上講，CSC 更接近于心臟，換言之更能線性分化為心肌細胞和血管細胞。在一些基礎實驗中，也證實CSC治療可以修復和改善缺血的心肌功能[8,9]。但 CSC 研究難點之一在于本身數(shù)目較少，在心臟遭受如心肌梗死等打擊時，難以完全替代、全部更新病變組織。故如何最大限度地激活和利用內源性的CSC是未來研究極具前途又亟待解決的一個堡壘。

心外干細胞：除此 CSC 以外，胚胎干細胞（ESC）、成肌細胞（myoblast）、誘導多能干細胞（iPSC）、骨髓干細胞[BMC,包括內皮祖細胞（EPC）、間充質干細胞（MSC）和造血干細胞（HSC）]等也能在人工誘導下定向分化為心肌細胞[10]。（1）ESC：自 1998 年首次分離得到人類ESC以來，不少研究已證實 ESC在體外誘導分化成為心肌細胞，使其能夠代替受損的心肌細胞。而且由ESC分化而來的心肌細胞可以同宿主細胞產生電機械偶聯(lián)，從而在移植細胞和宿主細胞之間產生同步收縮[11]。然而，分離不純的ESC源性的心肌細胞移植后，可能形成畸胎瘤；而且倫理學一直是限制ESC臨床應用的主要因素。（2）iPSC：通過逆轉錄病毒，將4種轉錄因子導入成熟細胞體內，可將該成熟細胞誘導成為多能干細胞[12]。該技術可以從自體成熟細胞誘導出自體多能干細胞，再誘導分化為目的細胞。但是探索能高效而經濟地誘導出足夠數(shù)量自體細胞方法一直是該技術的瓶頸；而且更為重要的問題在于，同成熟心肌細胞相比，由 iPSC 分化而來的心肌細胞尚不能達到完全、徹底的分化成熟狀態(tài)，從而難以長期穩(wěn)定地整合到心肌之中[13]。（3）成肌細胞：成肌細胞是在細胞移植心肌再生領域較早進行試驗的細胞。然而，在第一個關于成肌細胞移植的隨機對照試驗MAGIC中， 結果令人失望。在接受心肌注入自體骨骼肌成肌細胞的患者中，心律失常的發(fā)生率明顯增加[14]。故近幾年，關于骨骼肌成肌細胞移植入心肌的研究相

對較少。（4）BMC：BMC包括EPC、MSC和HSC，他們可以在體外誘導分化為多種細胞，其中包括心肌細胞和血管內皮細胞[15]。BMC具有易于提取、可自我更新、同種自體的優(yōu)勢，在心血管領域的應用有較大優(yōu)勢。初期開展的一些臨床試驗（STAR、 TOPCARE-CHD、REPAIRE-AMI、TIME）以及 Meta分析也顯示出BMC在心血管領域的應用具有不同程度的有效性[16, 17]。

2 旁分泌與干細胞

旁分泌： 一方面干細胞在心血管領域取得一定進展，另一方面也面臨著諸多困難，如干細胞的預處理、遴選最佳的細胞類型、增加歸巢、增殖、分化效率和建立細胞移植適應證等。因此更多的研究得以開展，以期探索干細胞在心血管領域具體的作用機制及臨床效用。其中干細胞治療中的旁分泌假說就是一個重要的理論進展。大量的試驗研究表明，大多數(shù)移植入心臟的干細胞并未能存活很長時間，甚至沒有觀察到他們在心臟中的增殖[18]。因此在臨床試驗中所觀察到的心功能的改善就不能完全用移植干細胞直接增殖分化而增加了心肌細胞數(shù)目這一假說來解釋。旁分泌概念繼而被提出，移植入心肌的干細胞可能會促進機體上調一些因子的表達，從而形成一個微環(huán)境，這個微環(huán)境一方面有利于原住的CSC和移植的心外干細胞激活、增殖、分化，還可以增強心肌細胞抗應激的能力[18-20]。BMC 移植中的缺血預適應這一技術手段，正是基于干細胞旁分泌概念的一個實際應用。 正是通過缺血預適應，增加了心肌中某些因子的表達，形成了一個有利的微環(huán)境， 從而提高干細胞歸巢的效率[21]。然而目前尚不明確該微環(huán)境的具體成分，但其中一些重要的因子被相繼提出，如心肌基質細胞衍生因子（SDF）、CXC趨化因子受體4（CXCR4）、血管內皮生長因子（VEGF） 等。

SDF-1α/ CXCR4：在旁分泌形成的微環(huán)境中，目前研究的較多的是 SDF-1α因子和它的受體 CXCR4。Abbott等[22]報道，在通過冠狀動脈結扎誘導的小鼠心肌梗死模型中，梗死區(qū)域和梗死周圍帶中的 SDF-1α的 mRNA 和蛋白明顯上調，同時血漿中的 SDF-1α下降。在靜脈內注入骨髓單核干細胞（BMSC）48 h后，觀察到同假心肌梗死組相比，有超過 （80.5±15.6）%的 BMSC 存在于梗死的心??；另一方面，注入 SDF-1α同 CXCR4 結合的阻滯劑 AMD3100，心肌梗死后心肌組織對 BMSC 的募集下降了（64.2±5.5）%；再者，通過腺病毒轉導，增加 SDF-1α可以顯著增加 BMSC 在梗死區(qū)域的募集。此后，在很多心肌梗死的動物模型和缺血性心臟病的患者中，觀察到了 SDF-1α/CXCR4 顯著上調。表明他們在這類疾病中的重要病理生理作用。同時 SDF-1 α/ CXCR4 表達的上調可以使干細胞遷移至梗死區(qū)域，產生血管新生、心肌存活、心功能改善等生物效應[23]。這些都表明了 SDF-1α/CXCR4 在干細胞激活、歸巢、增殖分化中扮演核心角色。

VEGF：Pons 等報道，長時間的培養(yǎng)，可增加MSC的細胞應激，而加入VEGF 后，則可以通過增加磷酸化 Akt 和抗凋亡蛋白（ Bcl-xL） 的表達，抑制細胞應激，增加 MSC 的增殖；另一方面，同單獨注入 VEGF 或 MSC 相比較，同時注入VEGF 和 MSC 可以增加 MSC 在梗死心肌中的遷移 2～3 倍，更益于改善心臟功能[24]。此外，還有研究報道，增加的 VEGF可以通過 SDF-1α/CXCR4 途徑激活 CSC，從而促進心肌組織的修復[25]。這些研究表明 VEGF 不論對于BMC還是原住的CSC而言，都是使他們歸巢、激活、增殖、分化的重要因子。

3 心臟震波治療（CSWT）與干細胞

CSWT 作為一種無創(chuàng)性新技術，核心是電磁式發(fā)生器，它由電磁線圈和金屬膜組成,高頻脈沖電流通過線圈時產生強磁場,強磁場產生的電磁能加速金屬膜與線圈分離,由此產生緩慢的低壓聲學脈沖。低壓聲學脈沖經周圍介質反射后向焦點匯聚并傳遞，其振幅在短短的幾百納秒中被非線性地增強，形成高能量沖擊波。在組織中形成剪切力和空穴效應，二者使活體組織內氣體形成微泡，這些微泡在震波作用下呈周期性的循環(huán)產生正負雙向壓縮運動，由此產生的一系列生物學效應。前期的動物實驗和臨床研究已經證實，CSWT 可以促進血管生成、抑制心室重構、改善左心室射血分數(shù)、抗炎、抗氧化等作用[26-28]。而這些作用機制與上文提及的干細胞微環(huán)境有著重要的內在聯(lián)系。

CSWT與VEGF：Nishida 等[27]用不同能量級的震波干預人臍靜脈內皮細胞，發(fā)現(xiàn)同對照組相比，能量在 0.09 mJ/mm2的震波顯著上調了 VEGF mRNA 和 VEGF 受體 Flt-1 的表達。這個能量級相當于震波碎石能量的十分之一。Yip 等[29]用震波干預從 SD 大鼠中提取的骨髓源性的單核細胞（BMDMNC），發(fā)現(xiàn)在能量為0.09 mJ/mm2的 280 次震波下，同其他能量級以及對照組相比，能顯著增加 VEGF 水平，此外還能增加新生 CD31+細胞的數(shù)目。表明震波不僅能促進 BMDMNC 表達VEGF，還能促進 BMDMNC 分化為內皮細胞。

CSWT 與 SDF-1α/CXCR4：Fu等[26]報道用縮窄器置于迷你豬前降支中段，建立心肌缺血模型。用心臟震波以0.09 mJ/mm2，800 次脈沖治療心肌缺血區(qū)域 3個 月。 結果顯示震波干預下的心肌中，SDF-1α/CXCR4 的 mRNA 和蛋白都顯著高于假性震波組；用免疫熒光標記的 SDF-1α、CXCR4陽性細胞也顯著高于對照組；在震波區(qū)域顯示出更高的血管密度和更低的纖維化程度。

CSWT 與心肌前體細胞：Nurzynska等[30]分別從人健康的心臟和缺血性心肌病的心臟中取材活檢， 分離出心肌、平滑肌、血管內皮細胞的前體細胞，用 CSWT 干預這些細胞，發(fā)現(xiàn)同對照組相比，不論是生理還是病理情況下，CSWT 都能促進這些前體細胞的增殖和分化。而且在健康心臟中，CSWT的這種促進作用更加明顯，表明 CSWT 可以通過促進原住于心肌的前體細胞增殖、分化，在心力衰竭（心衰）的早期可能更能抑制心室重構。

CSWT 與 BMC：CELLWAVE試驗是以慢性心衰患者為對象，將 CSWT 與BMC相結合，在德國開展為期 5 年的雙盲、安慰劑對照試驗。該試驗招募了 102 例心衰患者，單盲給予左心室前壁 CSWT 或假震波干預，24 h之后又隨機、雙盲地分為冠狀動脈內注入 BMC 組和安慰劑組。主要終點為左心室射血分數(shù)的改善；次要終點為核磁共振成像（MRI）所反映的心室壁厚度和主要心血管不良事件。結果顯示：CSWT+BMC治療同對照組相比可以顯著改善左心室射血分數(shù)， 且主要不良心血管事件的發(fā)生率降低[31]。

綜上所述，干細胞在心肌再生方面運用成敗的關鍵在于通過旁分泌形成一個有益于干細胞激活、歸巢、增殖、分化的微環(huán)境，而 SDF、CXCR4、VEGF 等因子正是該微環(huán)境中的核心要素。CSWT 已證實具有促進血管生成、抑制心室重

構、改善左心室射血分數(shù)、抗炎、抗氧化等作用，而這些作用的機理之一正在 CSWT 上調了 SDF、CXCR4、VEGF的表達。目前已開始零星出現(xiàn)將 CSWT 同干細胞聯(lián)合治療心血管疾病的研究，這些研究也都提示了二者結合更具優(yōu)勢。因此可以預見，CSWT 同干細胞相結合運用于心血管疾病將會是一個極具吸引力的領域。但在此之前，仍須高質量的研究來闡明干細胞在心肌再生方面精確的作用機制；旁分泌所形成的微環(huán)境的具體成分和作用機理；心臟震波治療對干細胞歸巢、激活、增殖、分化的作用機制。

[1] Lozano R, Naghavi M, Foreman K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet, 2012, 380: 2095-2128.

[2] 王振華. 心肌再生的研究進展. 中國循環(huán)雜志, 2011, 26: 480-482.

[3] Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S, et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science, 2009, 324: 98-102.

[4] Anversa P, LeriI A, Rta M, et al. Concise review: stem cells, myocardial regeneration, and methodological artifacts. Stem Cells, 2007, 25: 589-601.

[5] Anversa P, Kajsture J, Leri A, et al. Life and death of cardiac stem cells: a paradigm shift in cardiac biology. Circulation, 2006, 113: 1451-1463.

[6] Huang GN, Thatcher JE, Mcanally J, et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science, 2012, 338: 1599-1603.

[7] Bersell K, Arab S, Haring B, et al. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell, 2009, 138: 257-270.

[8] Chimenti I, Gaetani R, Barile L, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Mol Biol, 2012, 879: 327-338.

[9] Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell, 2003, 114: 763-776.

[10] Lovell MJ, Mathur A. Cardiac stem cell therapy: progress from the bench to bedside. Heart, 2010, 96: 1531-1537.

[11] Shiba Y, Fernandes S, Zhu WZ, et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature, 2012, 489: 322-325.

[12] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126: 663-676.

[13] Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Terzic A. Induced pluripotent stem cells: developmental biology to regenerative medicine. Nat Rev Cardiol, 2010, 7: 700-710.

[14] Mmnasche P, Alfieri O, Janssens S, et al. The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy （MAGIC） trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation. Circulation, 2008, 117: 1189-1200.

[15] Ohnishi S, Ohgushi H, Kitamure S, et al. Mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure. Int J Hematol, 2007, 86: 17-21.

[16] Strauer BE, Steinhoff G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol, 2011, 58: 1095-1104.

[17] 楊坤璂, 陳炳偉, 田濤, 等. 心肌內自體骨髓細胞移植治療缺血性心臟病的有效性研究. 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 59-62.

[18] Garbern JC, Lee RT. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell, 2013, 12: 689-698.

[19] Loffredo FS, Steinhauser ML, Gannon J, et al. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell, 2011, 8: 389-398.

[20] Williams AR, Hare JM. Mesenchymal stem cells: biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease. Circ Res, 2011, 109: 923-940.

[21] Lu G, Haider HK, Jiang S, et al. Sca-1+ stem cell survival and engraftment in the infarcted heart: dual role for preconditioninginduced connexin-43. Circulation, 2009, 119: 2587-2596.

[22] Abbott JD, Huang Y, Liu D, et al. Stromal cell-derived factor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury. Circulation, 2004, 110: 3300-3305.

[23] Ghadge SK, Muhlstedt S, Ozcelik C, et al. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther, 2011, 129: 97-108.

[24] Xie X, Cao F, Sheikh AY, et al. Genetic modification of embryonic stem cells with VEGF enhances cell survival and improves cardiac function. Cloning Stem Cells, 2007, 9: 549-563.

[25] Tang JM, Wang JN, Zhang L, et al. VEGF/SDF-1 promotes cardiac stem cell mobilization and myocardial repair in the infarcted heart. Cardiovasc Res, 2011, 91: 402-411.

[26] Fu M, Sun CK, Lin YC, et al. Extracorporeal shock wave therapy reverses ischemia-related left ventricular dysfunction and remodeling: molecular-cellular and functional assessment. PLoS One, 2011, 6: e24342.

[27] Nishida T, Shimokawa H, Oi K, et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation, 2004, 110: 3055-3061.

[28] Wang Y, Guo T, Ma TK, et al. A modified regimen of extracorporeal cardiac shock wave therapy for treatment of coronary artery disease. Cardiovasc Ultrasound, 2012, 10: 35.

[29] Yip HK, Chang LT, Sun CK, et al. Shock wave therapy applied to rat bone marrow-derived mononuclear cells enhances formation of cells stained positive for CD31 and vascular endothelial growth factor. Circ J, 2008, 72: 150-156.

[30] Nurzynska D, Di Meglio F, Castaldo C, et al. Shock waves activate in vitro cultured progenitors and precursors of cardiac cell lineages from the human heart. Ultrasound Med Biol, 2008, 34: 334-342.

[31] Assmus B, Walter DH, Seeger FH, et al. Effect of shock wavefacilitated intracoronary cell therapy on LVEF in patients with chronic heart failure: the CELLWAVE randomized clinical trial. JAMA, 2013, 309: 1622-1631.

2014-06-11）

（編輯：梅 平）

國家自然科學基金（81260027）

650032 云南省昆明市, 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 云南省心血管研究所 心內科

王靜 博士研究生 主要研究方向為介入心臟病學 Email：wangjing.md@hotmail.com*周超為共同第一作者 Email：zhouc2009@126.com

郭濤 Email：guotao20@hotmail.com

R541.4

A

1000-3614（2015）06-0602-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.024