MMP-2、MMP-9 與腦缺血以及針刺調(diào)節(jié)作用的研究進展*

成 越，倪光夏，2△

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京210023；2.江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇 南京210017)

缺血性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，損傷后發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，興奮性氨基酸毒性、梗死周圍去極化、炎癥和程序性細胞死亡是級聯(lián)反應(yīng)中的主要環(huán)節(jié)，它們發(fā)生在不同時間點，但有著重疊并相互聯(lián)系。腦梗死有著很高的致殘率和死亡率，是危害人類健康和生活質(zhì)量的主要病種之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2( MMP-2) 與基質(zhì)金屬蛋白酶-9( MMP-9) 參與了腦缺血再灌注急性期的損傷，加重了血腦屏障的破壞、腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的過程。而針刺治療腦缺血損傷具有獨特的優(yōu)勢，研究已經(jīng)證明針刺早期介入可以改善腦組織微循環(huán)及腦氧代謝，抗自由基損傷，抑制炎性反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡等［1］，目前有研究發(fā)現(xiàn)針刺在改善腦缺血損傷的過程中，MMP- 2 與MMP-9 的表達均有所下降，故針刺能夠下調(diào)MMP-2 與MMP-9 可能為針刺治療缺血性腦損傷的又一重要途徑。

1 基質(zhì)金屬蛋白酶概述

基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinase，MMPs)是一組鋅離子依賴性蛋白酶，主要的功能為降解細胞外基質(zhì)( extracellular matrix，ECM) 。根據(jù)MMPs 作用底物、分子結(jié)構(gòu)可分為6 組：膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、基質(zhì)溶解素及其它MMPs。MMPs 在生理狀態(tài)下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合，在病理狀態(tài)下參與組織重構(gòu)、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化等病理進程。

2 MMP-2、MMP-9 概述

2.1 MMP-2、MMP-9 的結(jié)構(gòu)特點及功能

MMP- 2 的分子量為72kD，又稱為明膠酶A，MMP-9 分子量為92kD，又稱為明膠酶B，其基本機構(gòu)都包括5 個結(jié)構(gòu)區(qū)： 信號肽區(qū)、N-末端前肽區(qū)、催化基團區(qū)、鉸鏈區(qū)、C-末端血紅素結(jié)合蛋白樣或纖維結(jié)合素樣的羧基末端區(qū)。MMP-2、MMP-9 一經(jīng)合成，即以無活性形式從細胞內(nèi)分泌到細胞外，被特殊的蛋白酶切割而產(chǎn)生活性。

2.2 MMP-2、MMP-9 的活性調(diào)控

MMP-2 與MMP-9 受3 個水平調(diào)控，即基因轉(zhuǎn)錄水平、無活性酶前體經(jīng)蛋白水解作用激活和特異性抑制因子調(diào)控。

許多具有生物活性的化合物都能夠調(diào)控MMP-2、MMP-9 的起始表達，能夠誘導其表達的細胞因子，包括白介素-1β( IL-1β) 、腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 、白介素-6( IL-6) 和趨化因子-8( CXCL-8) 。另外一些促使MMP-9 表達的激動劑有粘附分子、凝集素、一些細胞外基質(zhì)成分、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導物( EMM-PRIN)［2］以及一些能產(chǎn)生MMP-9 的細胞間的相互作用［3］。另外一些抗炎分子，比如白介素-4( IL-4) 、白介素10( IL-10) 、干擾素-β( IFN-β) 、類維生素A、糖皮質(zhì)激素都能夠抑制MMP-9 的表達［4］。MMP-9 與MMP-2 的誘導物具有不同的結(jié)構(gòu)，它們對不同的生物活性物質(zhì)敏感。在細胞外能夠促使MMP- 2 轉(zhuǎn)錄的因子有Ets- 1、C 反應(yīng)蛋白( CRP) 和血管內(nèi)皮生長因子( VEGF)［5-7］。

明膠酶與其他細胞外蛋白水解酶一樣以酶原的形式分泌，前肽半胱氨酸殘基的硫醇基與鋅離子結(jié)合位點結(jié)合以防止其他基團結(jié)合。明膠酶的激活分為兩個過程，第一階段，與硫醇基密切相關(guān)的低分子質(zhì)量的化合物阻斷硫醇基與鋅離子的結(jié)合，使酶的活性中心暴露，比如汞化合物［8］、一氧化氮( NO) 、MMP-9 前體的內(nèi)生性激活劑等［9］，但它們對硫醇基的抑制是可逆的，只與酶的變化結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此，它被稱為“半胱氨酸轉(zhuǎn)換”［10］。在激活過程中酶的重量不改變。第二個階段是前肽的降解，這一過程是不可逆的，并且酶的重量會降低。激活的MMP-9 重量為86 KDa，MMP-2為66 KDa。細胞外MMP-9 前體的激活需要組織蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、MMP-2、MMP-3、MMP-10、MMP-13［11］、血纖維蛋白溶酶［12］和透明質(zhì)酸［13］。在細胞內(nèi)MMP-2 前體的激活也是一個復(fù)雜的過程，發(fā)生在細胞表面。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1( MT1-MMP，MMP-14) 與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2( TIMP-2) 也參與了MMP-2 前體的激活［14］。其它膜型基質(zhì)金屬蛋白酶與MT1-MMP 發(fā)揮相同的作用。一些其他研究發(fā)現(xiàn)整合素β1 受體也可能與MMP-2 前體的激活有關(guān)，與MT1-MMP/TIMP-2 復(fù)合體的作用相似［15］。從細胞分泌出來以后，基質(zhì)金屬蛋白酶受自然組織抑制劑控制，自然組織抑制劑為21-34 KDa 的小分子蛋白質(zhì)，其中TIMP-1 主要能夠抑制MMP-9，TIMP-2 主要能夠抑制MMP-2［9］。

2.3 MMP-2、MMP-9 的表達細胞

MMP-9 在許多細胞中表達，白細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、樹突細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、角化細胞和贅生性細胞等都能產(chǎn)生MMP-9［4，10，16］。在腦缺血急性期，MMP-9 主要在內(nèi)皮細胞表達，其次是在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。MMP-2 的表達細胞主要有小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、脂肪細胞、星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞等［7，10，16］。

3 MMP-2、MMP-9 與腦缺血

MMP-2 與MMP-9 在缺血性腦損傷中發(fā)揮的作用是多方面的。眾所周知，動脈粥樣硬化是導致缺血性腦血管疾病的重要危險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，覆于粥樣斑塊上的內(nèi)皮細胞能夠表達MMP-2 與MMP-9，致使其含量增多，纖維成分被大量降解，使斑塊破裂，形成附壁血栓，脫落后阻塞腦血管導致腦缺血疾病的發(fā)生。腦缺血發(fā)生后再灌注又會產(chǎn)生多種炎性細胞因子—IL-1、TNF-α 等，它們激活轉(zhuǎn)錄因子如核因子B( NF-kB) ，誘導腦微血管內(nèi)皮細胞表達粘附分子-1( ICAM-1) 上調(diào)，并與白細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合激活MMP-9 前體，另外，纖維蛋白溶酶通過組織型纖溶酶原激活劑( t-PA) 誘導MMP-3 活性上調(diào)進而激活MMP-9 前體，最終都導致MMP-9 被過度激活； 此外，纖維蛋白溶酶還可以通過t- PA 激活MT1-MMP，進而激活MMP-2 前體，介導MMP-2 活性上調(diào)，最后MMP-9、MMP-2 都被過度激活［17］。由于MMP-2 能夠促使血腦屏障的開放，MMP-9 能夠降解血腦屏障中緊密連接蛋白的主要成分［18］，所以它們能夠?qū)е卵X屏障的破壞，這是最嚴重的損傷。另外，MMP-2 與MMP-9 還能夠?qū)е卵芡ㄍ感栽黾?、腦水腫、出血性轉(zhuǎn)化等一系列損傷。但有研究發(fā)現(xiàn)其中MMP-2 的表達要慢于MMP-9，它在缺血灶中心形成膠質(zhì)瘢痕后發(fā)揮主要作用。在缺血性腦卒中早期，MMP-2 的活性并沒有顯著上調(diào)，但是在隨后的階段，它的活性逐漸增加。一些實驗用MMP-2、MMP-9基因敲除動物模型來研究。在MMP-9 基因敲除小鼠中，在腦缺血損傷后早期，缺血灶中心的體積明顯小于野生型小鼠，而與MMP-9 相反，MMP-2 基因敲除小鼠梗死面積與野生型沒有明顯差異。這提示MMP-2 對急性腦損傷早期的作用小于MMP-9。

4 MMP-2、MMP-9 抑制劑與腦缺血

缺血性腦卒中是嚴重威脅人類生命的疾病，但治療手段有限，溶栓治療是目前急性腦缺血的治療措施之一，常用溶栓藥物有重組組織型纖溶酶原激活劑( rt-PA) 和尿激酶( UK) ，但是溶栓療法的使用也存在著很大的風險，容易導致隨后腦出血的發(fā)生。MMP-9 被認為參與了溶栓治療后腦出血及腦水腫的病理過程。腦缺血發(fā)生后，溶栓治療可激活內(nèi)源性及外源性的t-PA，t-PA 可能通過LDL 受體介導的蛋白通路( LDL receptor related protein，LRP) 及蛋白激酶激活受體通路( proteinase activated receptor1，PAR1) 使MMP-9 表達升高，從而加重了損傷的程度［19］。因此，溶栓前抑制其活性能夠減輕溶栓后損傷。

目前發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶組織抑制劑( TIMP) 分4型：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，它們除了對酶有抑制作用，還能影響紅細胞生成，有絲分裂發(fā)生與細胞凋亡［20-22］。另外還有一些合成抑制劑。大多數(shù)基質(zhì)金屬蛋白酶合成抑制劑屬于異羥戊酸合成物，通過結(jié)合鋅離子催化區(qū)來阻斷它的活性［23］。Rosenberg 等研究發(fā)現(xiàn)使用MMPs 的抑制劑BB-1101 能夠在再灌注3 h 內(nèi)降低血腦屏障的開放，并在24 h 內(nèi)降低腦水腫［24］。Yang 等發(fā)現(xiàn)使用BB-1101 后能夠防止緊密連接蛋白-5 和閉合蛋白的退化，從而防止BBB 的破壞［25］。通過核磁共振也發(fā)現(xiàn)BB-1101 能夠降低BBB 的通透性。但是在48 h 后，它對減輕損傷沒有顯著的作用［26］。另外常用的抑制劑有強力霉素，它屬于MMPs 廣譜抑制劑，能夠有效抑制MMP-9 的表達，并且降低溶栓后血腦屏障通透性，減輕溶栓后出血性轉(zhuǎn)化，進一步降低腦梗死體積。

5 針刺調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9 治療腦缺血

針刺治療腦缺血具有獨特的優(yōu)勢，目前認為針刺可以抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)凋亡基因表達、干預(yù)細胞凋亡信號傳導、抑制炎性因子等方面有效的治療［27］，且針刺操作便利、安全、無毒副作用。很多實驗研究均表明，針刺也能夠有效地抑制MMP-2、MMP-9 的表達，在腦缺血損傷早期介入，能夠降低腦損傷程度、延長溶栓時間窗并減輕溶栓后的并發(fā)癥等。張慧敏等通過針刺“百會”、“曲鬢”穴并進行手捻針治療后發(fā)現(xiàn)能夠有效改善腦缺血狀態(tài)下海馬CA3 區(qū)微血管內(nèi)皮MMP-9 的表達，且隨治療次數(shù)的增加，針刺的療效出現(xiàn)累加蓄積效應(yīng)，有效地減輕了腦缺血后腦梗死的體積，同時促進腦缺血腦微血管內(nèi)皮移行增生，促進新生血管內(nèi)皮形成，從而改善腦缺血損傷，這可能是通過抑制MMP-9 的轉(zhuǎn)錄從而抑制了其活性來實現(xiàn)的［28］。熊偉等發(fā)現(xiàn)針刺水溝、曲池、內(nèi)關(guān)、足三里可明顯降低MMP-2mRNA 和蛋白表達，從而減輕腦水腫的程度，達到了保護腦組織的目的［29］。另外，研究證實電針、穴位注射以及穴位埋線等都能有效地抑制MMP-2、MMP-9 的活性［30-31］，從而減輕腦缺血損傷。但是針刺具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究。

6 小結(jié)

綜上所述，MMP-2 與MMP-9 在腦缺血損傷中起到了重要的作用，因此，抑制其活性對治療腦缺血損傷有很重要的意義。針刺早期介入治療腦缺血損傷行之有效，應(yīng)該被更廣泛地運用到臨床中去，成為治療早期腦缺血損傷的一種新途徑。

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