胸腔積液沉淀物在惡性胸腔積液診斷中的價(jià)值

程方圓 王倩 綜述 鐘殿勝 審校

惡性胸腔積液的產(chǎn)生，預(yù)示著惡性腫瘤的進(jìn)展、生存期的縮短、生活質(zhì)量的下降。惡性胸腔積液的生存期與惡性腫瘤的原發(fā)部位、分期、病理分型等密切相關(guān)，平均中位生存期僅為3個(gè)月-12個(gè)月[1]。胸腔積液中找到腫瘤細(xì)胞或者是胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理變化是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。胸腔積液細(xì)胞涂片是診斷惡性胸腔積液的常規(guī)手段，其診斷率約為60%左右[3]。與細(xì)胞涂片相比，胸腔積液沉淀物通過(guò)包埋切片進(jìn)一步行常規(guī)染色、免疫組織化學(xué)染色等，不僅可以提高惡性胸腔積液的診斷率，而且可以進(jìn)一步明確惡性胸腔積液的原發(fā)病灶[4]。與胸腔鏡等有創(chuàng)檢查相比，此項(xiàng)技術(shù)操作方便、有創(chuàng)性小，可重復(fù)性高，對(duì)于無(wú)法獲得原發(fā)組織標(biāo)本的患者，不僅可以獲得病理學(xué)的診斷，而且可以進(jìn)行相關(guān)基因的檢測(cè)，指導(dǎo)靶向治療[5]。因此胸腔積液沉淀物對(duì)惡性胸腔積液的診斷具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1 胸腔積液沉淀物的制備

胸腔積液沉淀物的制備并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，不同的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，制備方式不同。文獻(xiàn)報(bào)道涉及到的方法有：細(xì)胞色素氧化酶凝血酶法（cytolyt-prefixed thrombin clot, CTC）、瓊脂凝膠法（HistoGel, HG）、血漿凝血酶法（plasma thrombin, PT）、促凝血酶原激酶-血漿法（thromboplastin-plasma, TP）[6,7]、過(guò)夜沉淀法、離心沉淀法[8]、反濾層沉積法、清蛋白法、簡(jiǎn)單沉降法[9]等。沉淀物切片制作人員的技術(shù)水平、切片中具有診斷意義的細(xì)胞的含量、染色后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)、免疫組化非特異性背景染色的干擾程度、閱片病理學(xué)家的專業(yè)知識(shí)等因素，均可影響沉淀物的診斷價(jià)值。不同的制作方法所需要的制作過(guò)程、消耗的時(shí)間、花費(fèi)是不同的。Kulkarni等[7]采用TP法制備沉淀物，結(jié)果顯示，TP法能夠保留更多具有診斷意義的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有相對(duì)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分布，更利于鑒別診斷。需要指出的是，目前還沒有公認(rèn)的最佳沉淀物的制備方法。

2 免疫組織化學(xué)染色的鑒別診斷價(jià)值

免疫組織化學(xué)染色是鑒別診斷不明病因胸腔積液的重要輔助手段。細(xì)胞涂片及沉淀物切片均可行免疫組織化學(xué)染色，與細(xì)胞涂片相比，沉淀物切片能夠明顯降低細(xì)胞的收縮、抗原的丟失，減少背景染色等影響鑒定染色結(jié)果的因素；另外，沉淀物切片中的細(xì)胞形態(tài)與組織病理切片中的細(xì)胞形態(tài)相似，并且保持著惡性細(xì)胞的組織排列方式，免疫指標(biāo)的陽(yáng)性定位在沉淀物切片與組織學(xué)標(biāo)本是一致的；上述優(yōu)點(diǎn)使沉淀物切片較細(xì)胞涂片更適合行免疫組織化學(xué)染色[10]。

常規(guī)染色一般可以明確細(xì)胞的良惡性，但反應(yīng)增生性間皮細(xì)胞、惡性間皮瘤細(xì)胞及腺癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)有一定的相似性，僅僅依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)，不易區(qū)分上述細(xì)胞。聯(lián)合應(yīng)用不同抗體的免疫組織化學(xué)染色，對(duì)上述三種細(xì)胞的鑒別診斷具有較高的敏感性和特異性[11]。例如：D2-40、calretinin、MOC-31抗體組合可用于鑒別惡性間皮瘤和轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞[12]。E-cadherin和fibronectin抗體組合可用于鑒別轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞和反應(yīng)性間皮細(xì)胞[13]。轉(zhuǎn)移性腺癌是惡性胸腔積液中最常見的病理類型，不同來(lái)源的腺癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)有一定的差異，但僅僅依靠形態(tài)學(xué)差異很難確定惡性腫瘤的來(lái)源，可結(jié)合病史、體格檢查、影像學(xué)檢查等，選擇組織特異性抗體的免疫組織化學(xué)染色以明確惡性胸腔積液的原發(fā)部位。臨床上可用甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor 1, TTF-1）和新天冬氨酸蛋白酶A （noval aspartic proteinase of the pepsin family A, napsin A）抗體組合鑒別轉(zhuǎn)移性肺腺癌[14]；人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2, Her2）、雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）抗體組合鑒別轉(zhuǎn)移性乳腺癌[15]；配對(duì)盒基因8（paired box gene 8, PAX8）和Wilms瘤基因（Wilms tumor 1, WT1）抗體組合鑒別轉(zhuǎn)移性卵巢腺癌[16]。需要指出的是，目前，沒有一種用于鑒別胸腔積液的良惡性或者原發(fā)部位的抗體具有100%的敏感性和特異性，故需要用一系列的抗體組合來(lái)鑒定。一些學(xué)者正致力于研究和尋找能明確不同性質(zhì)和來(lái)源的胸腔積液的“黃金抗體組合”。Su等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E-cadherin、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、calretinin和thrombomodulin抗體的組合可以用于腺癌和惡性間皮瘤/反應(yīng)性間皮細(xì)胞的鑒別；EMA和Des可以用于惡性間皮瘤和反應(yīng)性間皮細(xì)胞的鑒別。此外，Kim等[18]報(bào)道，胰島素樣生長(zhǎng)因子II信使RNA結(jié)合蛋白-3（insulinlike growth factor-II mRNA-binding protein 3, IMP3）不僅可用于鑒別轉(zhuǎn)移性腺癌與增生性間皮細(xì)胞，而且是轉(zhuǎn)移性胃腺癌的潛在的預(yù)后指標(biāo)。

既往有惡性腫瘤病史的患者，出現(xiàn)了惡性胸腔積液，也可能是由新發(fā)的惡性腫瘤引起，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，可以明確潛在的惡性腫瘤的部位[19]。此外，利用免疫組織化學(xué)染色可以證實(shí)一些少見的引起胸腔積液的病因。Teresa等[20]報(bào)道，通過(guò)沉淀物的免疫組織化學(xué)染色確診腎嫌色細(xì)胞癌引起的惡性胸腔積液。

3 胸腔積液沉淀物的診斷優(yōu)勢(shì)

指南推薦同時(shí)送檢胸腔積液細(xì)胞涂片及沉淀物，以提高惡性胸腔積液的診斷率[3]。與單純的細(xì)胞涂片相比，沉淀物可以使惡性胸腔積液的診斷率提高10%-15%[21,22]。Shivakumarswamy等[22]對(duì)60例原因待查的胸腔積液患者同時(shí)送檢細(xì)胞涂片及沉淀物切片檢查，結(jié)果顯示，切片比細(xì)胞涂片多確診了9例惡性胸腔積液，惡性胸腔積液的診斷率提高了15%。Ghosh等[4]收集60例以胸腔積液為首發(fā)臨床癥狀的患者，結(jié)合臨床資料，均不排除惡性胸腔積液，采用胸腔積液細(xì)胞涂片、沉淀物、支氣管鏡、胸膜活檢術(shù)、胸腔鏡等進(jìn)一步明確診斷，56例患者最終確診為惡性胸腔積液，其中根據(jù)沉淀物的病理結(jié)果確診了46例，而細(xì)胞涂片僅確診了22例。Koksal等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞涂片相比，沉淀物不僅可以提高肺癌引起的惡性胸腔積液的檢出率，而且可增加癌組織類型的確診率。

4 沉淀物在基因突變檢測(cè)中的價(jià)值

胸腔積液可以是肺腺癌首發(fā)的臨床表現(xiàn)，也可以在進(jìn)展期的肺腺癌中出現(xiàn)，其主要原因?yàn)閻盒阅[瘤胸膜轉(zhuǎn)移。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFRTKIs）對(duì)于具有EGFR基因突變的肺腺癌有很高的有效性，相反，對(duì)于無(wú)EGFR基因突變的肺腺癌效果很差或者無(wú)效。因此，EGFR基因突變的結(jié)果對(duì)于肺腺癌的靶向治療是至關(guān)重要的[24]。通過(guò)胸腔鏡或者經(jīng)皮肺活檢獲得的胸膜組織或者肺組織是做EGFR基因突變檢測(cè)的理想標(biāo)本。但是，對(duì)于某些肺腺癌伴惡性胸腔積液的患者，由于主客觀原因，可能無(wú)法獲得肺組織標(biāo)本。由于胸腔積液很容易獲得，有研究者使用胸腔積液對(duì)EGFR基因突變檢測(cè)的敏感性、特異性和實(shí)用性進(jìn)行了研究[25]。Liu等[5]通過(guò)突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)（amplified refractory mutation system, ARMS）測(cè)定胸腔積液（胸腔積液上清液和沉淀物）EGFR基因突變，結(jié)果顯示，胸腔積液標(biāo)本和轉(zhuǎn)移性胸膜腫瘤組織的EGFR基因突變狀態(tài)高度一致，提示胸腔積液可以作為腫瘤組織的替代物行基因檢測(cè)。Liu等[26]通過(guò)Sanger測(cè)序法和ARMS法，測(cè)定胸腔積液和腫瘤組織的EGFR基因突變，結(jié)果顯示：與ARMS法相比，Sanger測(cè)序法測(cè)定腫瘤組織EGFR突變的敏感性為81.8%，沉淀物EGFR突變的的敏感性為40%，ARMS法更適合測(cè)定沉淀物的EGFR突變。對(duì)于切片中細(xì)胞含量不足以行分子檢測(cè)的患者，可以行突變特異性抗體的免疫組織化學(xué)染色以明確基因突變的狀態(tài)[27,28]。Tsai等[28]利用免疫特異性抗體來(lái)檢測(cè)沉淀物的L858R和delE746-A750的突變，并給予突變陽(yáng)性的患者EGFR-TKIs靶向治療以明確治療的有效率，結(jié)果顯示免疫特異性抗體證實(shí)的突變陽(yáng)性的患者對(duì)EGFR-TKIs治療的反應(yīng)率為67%。免疫組織化學(xué)法操作簡(jiǎn)單，但敏感性和特異性均低于分子檢測(cè)技術(shù)[26]。此外，也可使用胸腔積液沉淀物進(jìn)行間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因的檢測(cè)[29]。目前關(guān)于沉淀物行基因檢測(cè)相關(guān)研究的標(biāo)本數(shù)目尚少，仍需要大量的臨床實(shí)踐來(lái)進(jìn)一步證實(shí)上述觀點(diǎn)。

5 結(jié)論

胸腔積液沉淀物取材方便、有創(chuàng)性小、相關(guān)檢查的可重復(fù)性高，聯(lián)合常規(guī)染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色等，可提高惡性胸腔積液的診斷率、確定惡性胸腔積液的原發(fā)病灶。對(duì)于無(wú)法獲得組織標(biāo)本的非小細(xì)胞肺癌患者，沉淀物代替組織標(biāo)本行相關(guān)基因的檢測(cè)，可指導(dǎo)靶向治療。