2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法解讀

楊曉莉，李輝，繩金房，錢(qián)維清，胡昌勤

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710065；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203；3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法解讀

楊曉莉1，李輝1，繩金房1，錢(qián)維清2，胡昌勤3

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710065；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203；3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

目的解讀2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法的主要增修訂情況。方法對(duì)比2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法與2010年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法的主要差異。結(jié)果2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法在檢查內(nèi)容、檢查方法、培養(yǎng)體系及質(zhì)量控制理念等方面都作了較大修訂。結(jié)論2015年版《中國(guó)藥典》將無(wú)菌檢查法完善成為更加科學(xué)并與國(guó)際接軌的檢查方法。

無(wú)菌檢查法；2015年版《中國(guó)藥典》；無(wú)菌藥品；培養(yǎng)體系；質(zhì)量控制

無(wú)菌檢查法是指用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的方法［1］，是藥品微生物檢查體系的重要組成部分，藥品微生物是關(guān)系藥品安全性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。無(wú)菌藥品的微生物污染是影響藥品生產(chǎn)質(zhì)量和引發(fā)臨床不良事件的主要因素，近年來(lái)發(fā)生的“欣弗事件及刺五加事件”等嚴(yán)重藥害事件都是無(wú)菌藥品的微生物污染導(dǎo)致［2］。目前，美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家或組織無(wú)菌檢查法已協(xié)調(diào)一致［3］。2010年版《中國(guó)藥典》及之前版本收錄的無(wú)菌檢查法與國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)在檢查理念、培養(yǎng)體系、方法要求等諸多方面有顯著差異。在國(guó)家藥品安全規(guī)劃與標(biāo)準(zhǔn)提高的目標(biāo)下，2015年版《中國(guó)藥典》借鑒國(guó)外藥典先進(jìn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，以新的控制理念為指導(dǎo)，結(jié)合我國(guó)國(guó)情對(duì)無(wú)菌檢查法的檢測(cè)范圍及環(huán)境要求、培養(yǎng)體系、方法適用性、檢查方法、偏差調(diào)查與過(guò)程控制等方面都做了較大修訂，進(jìn)一步完善了無(wú)菌檢查法，修訂后的無(wú)菌檢查法正逐步與國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)一致。筆者對(duì)比了2010年版《中國(guó)藥典》［4］，解讀2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法增修訂概況，以推動(dòng)新版藥典的貫徹實(shí)施。

1　檢測(cè)范圍和環(huán)境要求的變化

1.1檢測(cè)范圍

2010年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法的相關(guān)內(nèi)容統(tǒng)一為新的標(biāo)準(zhǔn)方法，解決了長(zhǎng)期以來(lái)各部之間相同方法要求不一致的問(wèn)題，其檢查范圍增大，要求更明確、嚴(yán)格。除了規(guī)定藥典要求無(wú)菌的藥品、原料、輔料、生物制品及其他品種外，還將無(wú)菌醫(yī)療器具明確納入檢查范圍。無(wú)菌醫(yī)療器具與無(wú)菌藥品的使用密切相關(guān)，影響著無(wú)菌藥品的安全使用。醫(yī)療器具在提高救治質(zhì)量的同時(shí)，也可能成為環(huán)境病原菌的傳播工具，造成醫(yī)院感染的發(fā)生［4］，新的要求必將嚴(yán)格無(wú)菌醫(yī)療器具的監(jiān)管，降低安全風(fēng)險(xiǎn)。

1.2環(huán)境要求

新版藥典無(wú)菌控制理念要求檢測(cè)環(huán)境應(yīng)與檢測(cè)需求相適應(yīng)，體現(xiàn)科學(xué)、合理的原則。目前，國(guó)際上對(duì)無(wú)菌檢測(cè)環(huán)境無(wú)明確要求，但原則上無(wú)菌檢查的試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)不低于無(wú)菌藥品的生產(chǎn)關(guān)鍵區(qū)域環(huán)境。相比2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的要求，2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定“無(wú)菌檢查應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查的要求”。無(wú)菌檢查條件和無(wú)菌檢查具體要求應(yīng)是什么呢？2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9 203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則中給出了具體指導(dǎo)意見(jiàn)，無(wú)菌檢查應(yīng)在B級(jí)背景下的A級(jí)單向流潔凈區(qū)域或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。新版藥典這一要求比之前的環(huán)境要求更嚴(yán)格，在無(wú)菌操作、預(yù)防措施、潔凈度確認(rèn)、隔離系統(tǒng)驗(yàn)證和環(huán)境監(jiān)控等方面要求一致。新版藥典在通則9203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則和9205藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則對(duì)試驗(yàn)環(huán)境和環(huán)境監(jiān)控有更詳細(xì)、具體的指導(dǎo)，增強(qiáng)了方法的可操作性、實(shí)用性、可靠性和規(guī)范性。

2　培養(yǎng)體系的變化

培養(yǎng)體系主要包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等方面，微生物培養(yǎng)體系的差異導(dǎo)致了2010年版《中國(guó)藥典》與國(guó)外藥典無(wú)菌檢查法的系統(tǒng)性差異，檢查結(jié)果之間存在不確定性及不可比性。隨著國(guó)際貿(mào)易的日益頻繁，中外藥典微生物培養(yǎng)體系的一致性需求成為一種趨勢(shì)，新版藥典無(wú)菌檢查法微生物培養(yǎng)體系與國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)一致。

1）無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基

2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法規(guī)定，以硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為無(wú)菌檢查的2種主要培養(yǎng)基，其中硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基主要用于需氧菌和真菌的培養(yǎng)，糾正了我國(guó)長(zhǎng)期存在的將微生物劃分為細(xì)菌和真菌的概念，以培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力和微生物的生長(zhǎng)需要作為分類(lèi)依據(jù)，將產(chǎn)品中可能污染的微生物在無(wú)菌檢查中按需氧菌、厭氧菌和真菌進(jìn)行培養(yǎng)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基自20世紀(jì)50年代起，國(guó)內(nèi)外藥典陸續(xù)將其收錄，用于藥品的無(wú)菌檢查。但研究發(fā)現(xiàn)，其存在局限，該培養(yǎng)基并不能使所有的梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)，并提出應(yīng)同時(shí)使用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為補(bǔ)充，這一建議隨后被國(guó)外藥典采納。但該培養(yǎng)基之所以能沿用至今，是因?yàn)槠渚哂胁豢商娲膬?yōu)勢(shì)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基能在普通有氧環(huán)境下提供厭氧條件，使需氧菌和厭氧菌均能生長(zhǎng)良好，并易于觀察結(jié)果，這提供了一般實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到的厭氧培養(yǎng)條件［5-6］。試驗(yàn)證明，2010年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法所用改良馬丁培養(yǎng)基與國(guó)外藥典胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基雖然在促微生物生長(zhǎng)能力（靈敏性）和適于微生物生長(zhǎng)的種群（廣譜性）上無(wú)顯著性差異，但胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的菌落形態(tài)較典型，且在培養(yǎng)霉菌方面略?xún)?yōu)于改良馬丁培養(yǎng)基，且胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基pH值為7.3±0.2，改良馬丁培養(yǎng)基的pH值為6.4±0.2，更接近中性的pH環(huán)境，適宜于需氧菌和真菌的生長(zhǎng)［7-9］。為與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌，新版藥典無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基取代了2010年版《中國(guó)藥典》收載的改良馬丁培養(yǎng)基。

新版藥典無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基中對(duì)原來(lái)的“選擇性培養(yǎng)基”名稱(chēng)進(jìn)行了更正。因?yàn)檫x擇性培養(yǎng)基是指能允許特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生長(zhǎng)的增菌培養(yǎng)基。而2010年版《中國(guó)藥典》及以前各版無(wú)菌檢查法一貫收載的“選擇性培養(yǎng)基”實(shí)際上是指為消除供試品的抑菌性而在原有培養(yǎng)基中加入中和劑、滅活劑后的培養(yǎng)基，不是嚴(yán)格意義上的選擇性培養(yǎng)基，新版藥典將其更名為準(zhǔn)確的“中和或滅活用培養(yǎng)基”。

另外，新版藥典無(wú)菌檢查法中還規(guī)定培養(yǎng)基的pH值應(yīng)在25℃測(cè)定。因溫度對(duì)pH值有影響，培養(yǎng)基在配制過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)加熱、溶解、滅菌等一系列處理，規(guī)定25℃的pH值也是對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)量提出了更嚴(yán)格的要求。

2）菌液制備用培養(yǎng)基

由于培養(yǎng)體系的變化，菌液制備所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等要素也做了相應(yīng)調(diào)整。其中用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基替代營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基替代營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基替代改良馬丁培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基替代改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。新增沙氏葡萄糖瓊脂和沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基用于白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液制備。

3）培養(yǎng)溫度

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，與醫(yī)藥相關(guān)的微生物大多是嗜溫的，其最適溫度在環(huán)境溫度和體溫之間［10］。絕大多數(shù)微生物最適生長(zhǎng)溫度為25～37℃。2015年版《中國(guó)藥典》硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基規(guī)定的培養(yǎng)溫度與2010年版硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基規(guī)定的培養(yǎng)溫度一致，為30～35℃，生物制品需增加1份20～25℃培養(yǎng)。但胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基規(guī)定的培養(yǎng)溫度為20～25℃，不同于原改良馬丁培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度23～28℃。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和大腸埃希菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃，白色念珠菌和黑曲霉最適生長(zhǎng)溫度為28℃，均為嗜溫型微生物。微生物在最適溫度生長(zhǎng)最快，超過(guò)最適溫度，熱會(huì)破壞菌體的某些蛋白質(zhì)而使細(xì)胞活力喪失，微生物生長(zhǎng)的最適溫度通常與規(guī)定的最高溫度相對(duì)較近而與規(guī)定的最低溫度相對(duì)較遠(yuǎn)。一般略低于最適溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)影響不大，而高于最適溫度會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響，因此結(jié)合培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)特性，盡量全面地覆蓋微生物檢出的種類(lèi)和數(shù)量，無(wú)菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度20～25℃和30～35℃滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

4）培養(yǎng)時(shí)間

在適宜培養(yǎng)條件下，細(xì)菌的群體生長(zhǎng)數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系遵循生長(zhǎng)曲線規(guī)律，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間有利于微生物的檢出［11］。無(wú)菌產(chǎn)品中的微生物在生產(chǎn)工藝過(guò)程中會(huì)受到損傷而處于亞致死狀態(tài)，受損微生物菌體在開(kāi)始繁殖前需要有一段修復(fù)損傷的時(shí)間，一般標(biāo)準(zhǔn)方法中推薦的通常只是多數(shù)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)的最佳時(shí)間。如果減少培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)數(shù)目大量減少，在定性試驗(yàn)方法中，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。方法適用性下規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間為不得超過(guò)5 d。

5）培養(yǎng)環(huán)境

氧氣作為許多微生物的最終電子受體，是其生長(zhǎng)的重要影響因素，如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等。但有一些微生物，氧氣的存在不利于其生長(zhǎng)，如生孢梭菌等。另有一些微生物的生長(zhǎng)也可不依賴(lài)氧氣的存在，屬兼性厭氧菌，如大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌等。在培養(yǎng)環(huán)境中不同微生物對(duì)氧氣的依賴(lài)程度不同，影響微生物的生長(zhǎng)速率和狀態(tài)的程度也不同。液體培養(yǎng)基煮沸可將溶解氧去除，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基與胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基在配制時(shí)需要煮沸。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中的還原劑巰基乙酸鈉能形成-200mV或更低的氧化還原電位，以減少或清除氧或氧化分子對(duì)厭氧微生物生長(zhǎng)的抑制作用。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制時(shí)微溫溶解，培養(yǎng)基中有一定的氧含量，有利于需氧菌、微需氧菌和兼性厭氧菌等其他微生物的生長(zhǎng)。新的培養(yǎng)體系提供了覆蓋更全面、更普遍的微生物培養(yǎng)環(huán)境，有利于污染菌的檢出。

3　方法適用性試驗(yàn)的變化

3.1名稱(chēng)的修訂

2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法將方法驗(yàn)證試驗(yàn)修訂為方法適用性試驗(yàn)。驗(yàn)證與適用性均是為保證方法的合理、有效而對(duì)方法進(jìn)行的測(cè)評(píng)，然而其側(cè)重點(diǎn)不同。方法學(xué)驗(yàn)證是通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明方法的運(yùn)行符合分析應(yīng)用要求的過(guò)程，側(cè)重于方法本身的科學(xué)性。適用性把儀器確認(rèn)、電子系統(tǒng)、分析方法、操作、樣品等因素作為一個(gè)整體的系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)，控制分析條件諸因素的影響，使檢測(cè)活動(dòng)能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。方法適用性試驗(yàn)包含方法驗(yàn)證試驗(yàn)，范圍更廣，層次更高，更為全面的質(zhì)量控制策略。分析方法驗(yàn)證、轉(zhuǎn)移和確認(rèn)的概念不同，適用范圍不同。方法確認(rèn)的目的是證明藥典分析方法或法定分析方法適用于被測(cè)樣品，被測(cè)樣品的質(zhì)量可控，方法可行，同時(shí)還證明方法使用人員有能力成功地操作藥典分析方法或法定分析方法［12］。新版藥典將原來(lái)的“驗(yàn)證、證明”的表述修訂為“確認(rèn)”，更準(zhǔn)確。

3.2菌種及菌液制備

增加了pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為菌液制備中的稀釋劑和洗脫劑，pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液除了能提供適宜的滲透壓、良好的細(xì)胞修復(fù)環(huán)境外，還消除了微生物培養(yǎng)過(guò)程中積累的代謝產(chǎn)物引起的酸堿度變化而帶來(lái)的不利影響。方法適用性試驗(yàn)使用的菌種與培養(yǎng)基靈敏度使用的菌種略有不同，方法適用性試驗(yàn)以大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種，對(duì)很多抗生素都天然耐藥，藥物敏感度不高，不適合做方法適用性。但假單胞菌屬的細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)體系的營(yíng)養(yǎng)要求高，所以適合做培養(yǎng)基適用性檢查。

3.3薄膜過(guò)濾法

薄膜過(guò)濾法是歷版《中國(guó)藥典》收載的無(wú)菌檢查法的首選方法，其具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，尤其是全封閉式薄膜過(guò)濾器具有不易污染的優(yōu)勢(shì)而在薄膜過(guò)濾法中得到廣泛應(yīng)用，新版藥典刪除了“取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中”，淘汰了開(kāi)放式薄膜過(guò)濾的操作方式。另外，在培養(yǎng)時(shí)間上要求不得超過(guò)5 d，對(duì)方法適用性試驗(yàn)進(jìn)程提出了比較靈活的要求。

3.4直接接種法

當(dāng)樣品的性狀不允許，且經(jīng)多種方法前處理后仍無(wú)法采用薄膜過(guò)濾法的供試品，可采用直接接種法［13］，由于培養(yǎng)體系的不同，方法適用性試驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基的接種管數(shù)也與2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的接種管數(shù)有差異。2010年版規(guī)定為硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，改良馬丁培養(yǎng)基4管；2015年版為硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基與胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各6管。

4　供試品無(wú)菌檢查的變化

4.1檢驗(yàn)數(shù)量

檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品的最小包裝容器的數(shù)量。2015年版《中國(guó)藥典》增加了新的要求，即：成品每亞批均應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查。因?yàn)樵趯?shí)際中，為完成某些生產(chǎn)操作步驟，可能有必要將1批產(chǎn)品分成若干亞批，最終合并成為1個(gè)均一批。無(wú)菌檢查是通過(guò)抽取1批產(chǎn)品中的部分樣品檢測(cè)來(lái)推斷整批產(chǎn)品是否無(wú)菌的統(tǒng)計(jì)學(xué)過(guò)程，因此如果檢驗(yàn)數(shù)量與所對(duì)應(yīng)的實(shí)際批量不符（亞批的狀況），就會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品通過(guò)無(wú)菌檢查的概率升高。對(duì)于亞批無(wú)菌檢查的特別規(guī)定，體現(xiàn)了藥品安全從嚴(yán)控制的理念。無(wú)菌檢查法中“表1批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗(yàn)數(shù)量”與“表2上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”專(zhuān)門(mén)用來(lái)描述對(duì)于檢驗(yàn)數(shù)量的規(guī)定，無(wú)菌檢查試驗(yàn)供試品的檢驗(yàn)數(shù)量不能低于藥典規(guī)定的最少檢驗(yàn)數(shù)量。

4.2檢驗(yàn)量

2010年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法中的檢驗(yàn)量是指1次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或mL），這顯然與“表2液體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”和“表3固體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”所表達(dá)的“每支供試品接種每種培養(yǎng)基的最少量”不完全相符，表達(dá)不夠準(zhǔn)確。新版藥典檢驗(yàn)量的概念結(jié)合無(wú)菌檢查法的特點(diǎn)和供試品的特殊性，定義為供試品每個(gè)最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g或mL），詳細(xì)清晰地表述了檢驗(yàn)量為每個(gè)最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的供試品量的下限。只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾，這有利于污染菌的檢出。刪除了“薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總量”的表述，一般來(lái)說(shuō)，薄膜過(guò)濾法具有適用于檢驗(yàn)量較大的供試品無(wú)菌檢查，該方法總檢驗(yàn)量通常都不會(huì)少于直接接種法的總檢驗(yàn)量，因此，2015年版《中國(guó)藥典》關(guān)于該問(wèn)題不再贅述。

4.3陽(yáng)性對(duì)照

2015年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法將陽(yáng)性對(duì)照菌的選擇細(xì)化，將原來(lái)抗細(xì)菌的供試品，以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照修訂為無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌，抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌，再加上抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對(duì)照菌，這樣就使供試品對(duì)照菌的選擇更科學(xué)，對(duì)方法的控制更具針對(duì)性。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)置是必要的，是單次試驗(yàn)條件下檢測(cè)方法有效的有力證據(jù)。對(duì)于某些具有抑菌性的藥物，若陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性生長(zhǎng)，則證明所采取的稀釋、中和、滅活等去除抑菌性的方法是有效的。

4.4供試品處理及接種培養(yǎng)基

該項(xiàng)下主要描述了無(wú)菌檢查前，需要對(duì)樣品進(jìn)行消毒處理以避免人為污染而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，提供了容器內(nèi)具有一定真空度供試品的前處理方法。該部分屬于文字及編排順序的變更，內(nèi)容無(wú)實(shí)質(zhì)性變化。

4.5薄膜過(guò)濾法

隨著科技水平的發(fā)展，封閉式薄膜過(guò)濾器因其不易污染、操作方便等優(yōu)勢(shì)逐漸取代了一般薄膜過(guò)濾器，因此新版藥典無(wú)菌檢查法不再收載一般薄膜過(guò)濾器及其相關(guān)操作。對(duì)于水溶液供試品，明確了“可直接過(guò)濾，或混合至100mL適宜稀釋液的無(wú)菌容器中，混勻，立即過(guò)濾。這樣可使樣品充分分散。整合了2010年版《中國(guó)藥典（三部）》關(guān)于生物制品薄膜過(guò)濾法和接種培養(yǎng)基的規(guī)定?？偨Y(jié)近年來(lái)醫(yī)療器具無(wú)菌檢查的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可聯(lián)合使用薄膜過(guò)濾法和直接接種法，增加了具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品無(wú)菌檢查方法的規(guī)定。

4.6直接接種法

新版藥典明確了直接接種法的適用范圍，即直接接種法適用于無(wú)法用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查的供試品。直接接種法操作相對(duì)煩瑣，加入中和劑或滅活劑等處理時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)其他影響結(jié)果觀察的狀況，因此刪除了關(guān)于去除抑菌性的相關(guān)規(guī)定。但直接接種法在進(jìn)行固體制劑、非水溶性供試品、敷料、腸線、縫合線、滅菌醫(yī)用器具、放射性藥品等特殊樣品的無(wú)菌檢查時(shí)有其明顯優(yōu)勢(shì)。限定樣品的加入量與培養(yǎng)基體積的比例不大于10%，以避免培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力的減弱或是不利于微生物生長(zhǎng)的過(guò)高滲透壓。

4.7表1，2，3的變化

2015年版《中國(guó)藥典》整合了原表1，2，3的相關(guān)內(nèi)容及生物制品的有關(guān)規(guī)定，重新形成了新的表1，2，3，分別為表1批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗(yàn)數(shù)量，表2上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量，表3供試品的最少檢驗(yàn)量，在表2和表3中合并了固體制劑和液體制劑，將上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)量獨(dú)立成表2，將最少檢驗(yàn)量和最少檢驗(yàn)數(shù)量分開(kāi)表述。表1，2均為形式上的整合，內(nèi)容上基本無(wú)實(shí)質(zhì)變化。表3中參考USP重新調(diào)整了液體制劑供試品裝量所對(duì)應(yīng)的每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量，整體上看，較小規(guī)格（V<100mL）最少檢驗(yàn)量有所增大，增加檢驗(yàn)量有利于污染微生物的檢出，大規(guī)格（V>100mL）有所減少，主要是為保護(hù)濾膜的完整性和截留微生物不會(huì)受到較大體積液體濾過(guò)的影響，同時(shí)，也有利于一些不易通過(guò)濾膜（如脂肪乳樣品）的無(wú)菌檢查。帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器具（如輸液袋），要求每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量為1/2的內(nèi)表面積，相比之前要求更為科學(xué)、詳細(xì)。

4.8培養(yǎng)與觀察的變化

無(wú)菌檢查試驗(yàn)中微生物培養(yǎng)時(shí)間是理論與經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，新版藥典無(wú)菌檢查法規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間為14 d，如培養(yǎng)14 d后不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)3 d觀察結(jié)果，這有別于2010年版《中國(guó)藥典》培養(yǎng)14 d轉(zhuǎn)種后細(xì)菌培養(yǎng)2 d，真菌培養(yǎng)3 d的規(guī)定。新版藥典在培養(yǎng)及觀察項(xiàng)下還要求對(duì)接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成2等份，1份置30～35℃培養(yǎng)，1份置20～25℃培養(yǎng)。

5　偏差調(diào)查與菌種鑒定

2010年版與2015年版《中國(guó)藥典》在結(jié)果判斷上無(wú)變化，但更加強(qiáng)調(diào)了偏差調(diào)查。如果無(wú)菌產(chǎn)品的無(wú)菌檢查結(jié)果異常，應(yīng)開(kāi)展偏差調(diào)查。偏差調(diào)查關(guān)系著產(chǎn)品質(zhì)量及質(zhì)量管理體系的良好運(yùn)行。偏差分析實(shí)施的過(guò)程可以概括為如下流程：偏差確認(rèn)→偏差評(píng)估→實(shí)驗(yàn)室調(diào)查→全范圍偏差調(diào)查→總結(jié)調(diào)查結(jié)果（糾偏措施+決定放行）［14］。微生物實(shí)驗(yàn)室的偏差調(diào)查應(yīng)對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行全面回顧和溯源，從人員、檢驗(yàn)方法、方法理解、注意事項(xiàng)、操作程序、儀器材料、對(duì)照試驗(yàn)、試驗(yàn)環(huán)境、培養(yǎng)基、試驗(yàn)菌株等方面進(jìn)行調(diào)查，查找原因深入分析，并及時(shí)采取糾偏措施，形成調(diào)查報(bào)告。一個(gè)完整的偏差調(diào)查報(bào)告至少應(yīng)包括偏差概述、偏差調(diào)查（如果是試驗(yàn)過(guò)程污染經(jīng)進(jìn)行菌種的相關(guān)鑒定，查找污染源）、偏差分析、結(jié)論與糾偏措施、糾偏結(jié)果的微生物學(xué)評(píng)價(jià)及建議措施。如實(shí)驗(yàn)室調(diào)查確認(rèn)異常/超標(biāo)結(jié)果并非試驗(yàn)偏差，則微生物實(shí)驗(yàn)室要聯(lián)合質(zhì)量管理部門(mén)和相關(guān)人員進(jìn)行全面調(diào)查并形成調(diào)查報(bào)告［15］。無(wú)菌檢查以1次檢查為準(zhǔn)，不允許復(fù)試。但若試驗(yàn)經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，可重試。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果分離的微生物進(jìn)行鑒定，以判斷試驗(yàn)是否重試。實(shí)驗(yàn)室要結(jié)合具體狀況選擇適宜的方法對(duì)疑似菌確認(rèn)，出現(xiàn)爭(zhēng)議時(shí)以現(xiàn)行版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》為準(zhǔn)［2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則9204微生物鑒定指導(dǎo)原則］。在微生物鑒定相關(guān)的核酸、脂肪酸，蛋白質(zhì)的分析儀器設(shè)備基礎(chǔ)上建立起來(lái)的儀器分析法是菌種（株）鑒定未來(lái)發(fā)展的方向。現(xiàn)階段的API檢測(cè)是細(xì)菌鑒定的常用方法，16SrDNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用也發(fā)展成熟，傅里葉紅外微生物溯源分析系統(tǒng)等也發(fā)展較快。文獻(xiàn)報(bào)道，生化鑒定操作相對(duì)復(fù)雜煩瑣，而16SrDNA測(cè)序技術(shù)鑒定細(xì)菌具有高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)［16］，再輔以血清學(xué)實(shí)驗(yàn)或其他分子生物學(xué)技術(shù)，能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型鑒定。藥品微生物實(shí)驗(yàn)室在藥品無(wú)菌檢查的偏差調(diào)查時(shí)可根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，結(jié)合16SrDNA測(cè)序和生化鑒定，選擇適合的菌種鑒定方法。

6　無(wú)菌產(chǎn)品的全過(guò)程控制

無(wú)菌是指物品滅菌或除菌后不含活的微生物，如微生物和無(wú)菌檢查所用的物品經(jīng)滅菌處理后不得含活的微生物，但在實(shí)際中沒(méi)有絕對(duì)無(wú)菌的存在，無(wú)菌產(chǎn)品的無(wú)菌性常以無(wú)菌保證水平（SAL）來(lái)表示，通常為10-n，一般采用終端滅菌的產(chǎn)品其SAL≤10-6，即在百萬(wàn)件或以上物品中最多只允許有1件物品仍存在活微生物，視為合格［17］。由于無(wú)菌檢查法在采樣、培養(yǎng)條件等方面存在先天缺陷［18］，無(wú)菌產(chǎn)品的微生物安全性不能僅依賴(lài)于無(wú)菌檢查，應(yīng)強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品的全過(guò)程控制。無(wú)菌檢查是為了證明一個(gè)否定的結(jié)論，是一個(gè)推斷的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)結(jié)論，對(duì)于終端滅菌的產(chǎn)品這一假設(shè)是合理的，但前提是滅菌器的熱量分布均勻，或射線劑量分布均勻。參數(shù)放行需要反復(fù)、定期的監(jiān)控和證明，為終端滅菌產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)提供了依據(jù)。因此現(xiàn)階段下，結(jié)合我國(guó)國(guó)情，強(qiáng)調(diào)無(wú)菌產(chǎn)品的全過(guò)程質(zhì)量控制理念，盡可能從設(shè)備、物料、環(huán)境、人員、技術(shù)、方法等角度達(dá)到對(duì)無(wú)菌產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過(guò)程進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，以提高無(wú)菌檢查結(jié)果的可信度，從根本上保障無(wú)菌產(chǎn)品的安全性和有效性。

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R954；R921.2

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1006-4931（2015）24-0007-05

楊曉莉，副主任藥師，研究方向?yàn)槲⑸餀z驗(yàn)，（電話）029-62288451（電子信箱）yangxiaoli0206@163.com。

2015-07-14）