鮑曼不動桿菌黏附相關(guān)機制研究進展

黎皓思，潘頻華

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）屬革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界，系條件致病菌。近年來，由于多重耐藥菌株的出現(xiàn)以及感染人數(shù)的上升，鮑曼不動桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染最為重要的病原菌之一［1］。鮑曼不動桿菌在醫(yī)院的高度流行可能由以下因素導致：耐藥性、抵抗干燥的能力、黏附于醫(yī)療器械表面并形成生物膜以及黏附于易感人群的皮膚和黏膜的能力。在這些因素的共同作用下，該細菌得以長期生存于醫(yī)院內(nèi)各種設(shè)備、器械、紡織物表面以及醫(yī)護工作者的皮膚表面，并定植于易感患者上皮細胞表面，難以清除［2-3］?，F(xiàn)就鮑曼不動桿菌黏附相關(guān)機制加以綜述，為預(yù)防和控制鮑曼不動桿菌感染提供新的思路。

1 概述

鮑曼不動桿菌的黏附性是其重要的毒力決定因子和致病因素［4-5］。鮑曼不動桿菌可以在多種非生物表面黏附并形成生物膜，如玻璃、多種塑料（聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯等）以及不銹鋼等［6］，這些材料都普遍用于制造各類醫(yī)療器械。該細菌也能黏附到生物各種類型的細胞表面，包括人鼻咽部上皮細胞、喉上皮細胞、支氣管上皮細胞、肺上皮細胞、宮頸上皮細胞、新生角化細胞、白念珠菌絲等［4，7-9］。鮑曼不動桿菌對生物表面的黏附過程主要包括初期的物理化學作用階段以及后期的分子和細胞作用階段。它是由細菌特性、物體的表面特性、環(huán)境因素等眾多因素相互影響的復雜過程。不同菌株之間黏附能力有所不同，其機制也不盡相同［10］。近年研究表明，鮑曼不動桿菌在非生物表面與生物表面的黏附機制既有很多共性又有一定的區(qū)別［1］，其黏附機制涉及到一系列因素，包括菌毛、細胞表面的多種蛋白、調(diào)控因子、環(huán)境因素、二價陽離子濃度、物體表面粗糙度等。根據(jù)目前的研究結(jié)果得知，其中一部分因素對非生物表面和生物表面的黏附均有關(guān)鍵作用，體現(xiàn)出2種表面黏附機制的共同點以及潛在的聯(lián)系；另一部分僅被發(fā)現(xiàn)在1 種表面發(fā)揮其作用。下面將黏附相關(guān)機制分成兩部分來分別闡述。

2 作用于2種表面的黏附相關(guān)因素

2.1 生物膜

生物膜（biofilm）是鮑曼不動桿菌的重要毒力因子，其對細菌在非生物表面的黏附起著至關(guān)重要的作用。鮑曼不動桿菌耐藥性和抵抗干燥、營養(yǎng)缺乏等不利條件的特性可歸因于其在黏附的表面形成生物膜的能力［7］，可以說生物膜的形成是鮑曼不動桿菌在非生物表面得以長期生存最為重要的原因。細菌生物膜主要由細菌及其自身分泌的細胞外基質(zhì)組成，其形成是一個復雜而有序的動態(tài)過程，一般分為5個階段：最初的定植階段、不可逆的黏附階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段及解聚再定植階段。菌毛、生物膜相關(guān)蛋白（biofilm-associated protein，Bap）和聚-β-1-6-N-乙酰氨基葡萄糖胺（poly-beta-1-6-N-acetylglucosamine，PNAG）以及多種調(diào)控因子等眾多因素參與了生物膜形成的過程。

研究證實，鮑曼不動桿菌可以在生物表面（人肺泡上皮細胞、人類皮膚模型、白念珠菌絲）形成生物膜［2，11］。其在人類皮膚表面形成生物膜的能力可能對其長期生存于皮膚表面有重要作用［11］。

2.2 菌毛

2.2.1 作用于非生物表面的菌毛及其調(diào)控因子Eijkelkamp等［8］研究證明，鮑曼不動桿菌ATCC 19606的菌毛在生物膜形成早期階段有關(guān)鍵作用，如果缺失會導致生物膜無法形成。菌毛的蛋白由菌毛合成系統(tǒng)的基因編碼產(chǎn)生，該系統(tǒng)為6個基因組成的csu 操縱子（csuA／BABCDE）。其中csuAB、csuA、csuB3個基因編碼的蛋白質(zhì)為菌毛的亞單位結(jié)構(gòu)；csuC 編碼的蛋白質(zhì)稱為侶伴蛋白（chaperone），參與菌毛蛋白的轉(zhuǎn)運；csuD 編碼的蛋白稱為引導分子（usher），是一個具有孔道的蛋白，可以結(jié)合黏附素（adhesin）；csuE 編碼的蛋白為黏附素分子［6］。菌毛合成系統(tǒng)是鮑曼不動桿菌生物膜形成的必要條件，對鮑曼不動桿菌ATCC17978 csuB突變株與其他無突變的菌株相比，其結(jié)合非生物表面水平降低［8］。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌ATCC19606菌株表面可形成2種延伸物質(zhì)，即薄、短菌毛樣結(jié)構(gòu)（平均長約29 nm；范圍5～140 nm）和長延伸物質(zhì)（平均長約260 nm；范圍143～1 008 nm），后者由csuA／BABCDE 編碼產(chǎn)生。

隨后，研究發(fā)現(xiàn)BfmRS雙組分調(diào)控系統(tǒng)（twocomponent regulatory systems）可以調(diào)控csuA／BABCDE 菌毛合成系統(tǒng)，繼而影響菌毛的合成、細菌的黏附和生物膜的形成。該調(diào)控系統(tǒng)由感受器激酶BfmS 和反應(yīng)調(diào)控子BfmR 組成，分別由bfmS及bfmR 基因編碼合成。感受器激酶BfmS可以感受細胞間的信息，如細菌濃度、營養(yǎng)物質(zhì)、游離陽離子濃度等，從而激活由BfmR 調(diào)控的菌毛組裝。在感受器激酶BfmS正常，而BfmR 反應(yīng)調(diào)控子失活的情況下，csu 不表達，從而無法產(chǎn)生菌毛，細菌黏附于塑料表面及形成生物膜的能力均受損。但是，BfmS的失活僅部分干擾了生物膜的形成，對下游靶基因沒有影響。表明BfmR 可能可以被其他感受器激酶激活［12］。Liou等［13］也證明了在感受器激酶BfmS失活的鮑曼不動桿菌ATCC17978菌株在非生物表面仍可形成生物膜，但有所減少。

最近研究發(fā)現(xiàn)，一種用于治療霍亂弧菌（Vibrio cholera）的藥物virstatin可以抑制鮑曼不動桿菌的菌毛合成，以此來減少生物膜的形成［14］。實驗發(fā)現(xiàn)，virstatin對生物膜形成的抑制作用主要體現(xiàn)在其形成的初始階段，在后期階段（48 h）對其作用減弱［14］，此現(xiàn)象與菌毛主要參與生物膜形成的早期階段［8］的事實相吻合，也進一步證明了菌毛在生物膜形成中的重要作用。

2.2.2 作用于生物表面的菌毛 菌毛和菌毛樣結(jié)構(gòu)同樣也參與鮑曼不動桿菌對真核細胞的黏附及侵入過程［15］。與其黏附于非生物表面有所不同的是，對真核細胞的黏附過程不依賴于csuA／BABCDE產(chǎn)生的菌毛。研究證實，csuE 突變菌株較親本菌株對氣道上皮細胞（H292）的黏附增強。親本菌株表面可觀察到長短不一的2種菌毛樣結(jié)構(gòu)，而csuE 突變株表面僅出現(xiàn)薄、短菌毛［16］。由此可知，薄、短菌毛在細菌與氣道上皮細胞的黏附中起重要作用。另外，有研究證明了感受器激酶BfmS失活的鮑曼不動桿菌ATCC17978 菌株對真核細胞的黏附顯著減少［13］，其具體機制還有待進一步研究。

2.3 GacSA 雙組分調(diào)控系統(tǒng)

在GacSA 雙組分調(diào)控系統(tǒng)中，GacS感受器激酶通過GacA 反應(yīng)調(diào)控子調(diào)控毒力相關(guān)的基因表達。GacSA 雙組分調(diào)控系統(tǒng)控制菌毛合成、生物膜和運動，這些因素都有助于增強哺乳動物感染模型中細菌的毒力，是重要的發(fā)病機制［17］。

GacS感受器激酶也可調(diào)節(jié)csu 操縱子。與親本菌株相比，GacS突變體的菌毛顯著縮短，在塑料表面形成的生物膜更薄，細胞的分布更稀疏。除了調(diào)節(jié)csu操縱子，GacS也可以調(diào)控與生物膜的形成相關(guān)的其他基因［17］。

2.4 生物膜相關(guān)蛋白與疏水性

鮑曼不動桿菌Bap是一種含有8 621個氨基酸的表面蛋白［18］。Bap暴露在細菌表面，可以維持生物膜在非生物表面的成熟結(jié)構(gòu)［9］。實驗證實，Bap基因缺失可導致該細菌在蓋玻片表面無法維持生物膜的厚度與體積［18］。Bap 具有與免疫球蛋白樣折疊家族內(nèi)細菌黏附素相似的結(jié)構(gòu)，并且可能通過介導細胞間黏附的方式來支持生物膜的成熟結(jié)構(gòu)［18］。

Bap也可以促進鮑曼不動桿菌對宿主細胞的黏附，其機制可能為Bap 增加細菌表面的疏水性所致［9］。在鮑曼不動桿菌與人支氣管上皮細胞以及人新生角化細胞黏附實驗中，表達Bap的細菌對細胞的黏附比Bap 缺陷細菌顯著增加。另外，研究表明，表達Bap的野生型Ab307菌株細胞很容易整合到鯨蠟烷層，其程度顯著超過Bap 缺陷細胞［9］，表明Bap提高了細菌細胞表面的疏水性。鮑曼不動桿菌Bap包含一段保守序列，其也存在于透明重復（hyaline repeat，HYR）模塊中［18-19］。HYR 模塊在真核細胞黏附蛋白和細菌黏附蛋白中均有作用。該HYR 結(jié)構(gòu)域還包含保守的疏水殘基［19］。這些保守殘基可能參與細胞表面的疏水性形成［9］。也有研究表明，鮑曼不動桿菌表面脂肪酸組分可以改變其疏水性，隨之改變細菌的黏附、運動和毒力［20］。由此推測，Bap促進鮑曼不動桿菌對宿主細胞的黏附可能由于其增加細菌表面的疏水性所致。

另外，細菌表面的疏水性與其對非生物表面的黏附性呈正相關(guān)［21］。研究表明，具有高度疏水性指數(shù)的鮑曼不動桿菌菌株可以分別在靜態(tài)和動態(tài)條件下形成高強度的生物膜［22］，從而增強其黏附性。有趣的是，臨床上分離的菌株比自然環(huán)境中分離菌株具有更強的疏水性［23］。

2.5 外膜蛋白

外膜蛋白（outer membrane proteins，Omp）是鮑曼不動桿菌的一個重要毒力因子。研究表明，雖然OmpA 對生物膜形成和發(fā)展不是必需的，但是其對于鮑曼不動桿菌在聚苯乙烯表面形成堅固的生物膜時必須存在，并且這個過程不依賴于csuA／BABCDE 編碼產(chǎn)生的菌毛［7］。

Omp（如OmpA）可介導鮑曼不動桿菌黏附和入侵上皮細胞［15］。其中，在與白念珠菌絲和上皮細胞黏附的過程中，OmpA 是絕對必需的［4］。Omp是通過與宿主細胞的纖維連接蛋白（fibronectin）相結(jié)合而介導鮑曼不動桿菌黏附于宿主細胞，所以O(shè)mp又被稱為纖維連接蛋白結(jié)合蛋白（fibronectinbinding protein，F(xiàn)BP）。研究證明，中和纖維連接蛋白的特異性抗體顯著減少了鮑曼不動桿菌對人肺上皮細胞（A549 細胞）的黏附性。同樣，中和OmpA的特異性抗體也使鮑曼不動桿菌對A549細胞的附著力顯著下降。除了OmpA，與纖維連接蛋白相互作用的外膜蛋白還有：EF-Tu、TonB 依賴性銅受體和34 ku的Omp，它們均被稱之為FBP［24］。

2.6 不動桿菌屬三聚自主轉(zhuǎn)運蛋白

不動桿菌屬三聚自主轉(zhuǎn)運蛋白（Acinetobacter trimeric autotransporter，Ata）是暴露在鮑曼不動桿菌外膜的物質(zhì)，其介導對細胞外基質(zhì)／基底膜（extracellular matrix／basal membrane，ECM／BM）蛋白的黏附以及對Ⅳ型膠原蛋白的黏附，對生物膜形成也有重要作用［25］。

2.7 二價陽離子濃度

鐵、鈣、鎂、錳、銅等多種二價陽離子濃度可以影響?zhàn)じ郊吧锬ば纬?。研究證實，在鐵螯合劑存在的低濃度游離鐵離子環(huán)境下，對塑膠表面的黏附及生物膜形成能力均加強［6］，而高濃度的鐵離子則抑制生物膜生成。鈣、鎂、錳、銅二價陽離子對生物膜的作用與鐵離子相反。低濃度鈣離子使細菌對人呼吸道上皮細胞表面及塑料表面的黏附、生物膜形成能力均顯著下降［26］，高濃度的鈣離子對生物膜合成有促進作用。其原因為高濃度鈣離子可以穩(wěn)定和促進細胞外基質(zhì)的表達，增加生物膜結(jié)構(gòu)聚集性，降低生物膜分解功能。

2.8 多重耐藥菌株與生物膜形成

鮑曼不動桿菌多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）菌株具有形成大量生物膜的能力，并且超廣譜β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaPER-1能影響生物膜的形成。研究證實，攜帶blaPER-1 的多藥耐藥鮑曼不動桿菌比未攜帶blaPER-1的菌株有顯著增高的生物膜形成能力。同樣，其與生物表面如支氣管上皮細胞的黏附能力也呈正相關(guān)［26］。多重耐藥菌株與生物膜形成的相關(guān)性，是解釋鮑曼不動桿菌以抵抗多種抗菌藥物的狀態(tài)得以長期生存于醫(yī)院物體表面的重要原因。

3 作用于1種表面的黏附相關(guān)因素

3.1 生物表面

鮑曼不動桿菌表達磷酰膽堿（phosphorylcholine，ChoP），并通過血小板活化因子受體（plateletactivating factor receptor，PAFR）黏附人肺上皮細胞，隨后可激活一系列級聯(lián)反應(yīng)，G 蛋白偶聯(lián)磷脂酶C（phospholipase C，PLC）通道、網(wǎng)格蛋白和βarrestins，以入侵宿主細胞。研究表明，表達ChoP蛋白的Omp參與細菌對上皮細胞的黏附和入侵。進一步實驗證實，在不表達ChoP蛋白的OmpA 介導下，鮑曼不動桿菌對上皮細胞的黏附和入侵水平比表達Chop 蛋白的鮑曼不動桿菌大大降低［15］。PAFR也是鮑曼不動桿菌在體內(nèi)傳播所需要的宿主蛋白。經(jīng)PAFR 拮抗劑處理后，鮑曼不動桿菌在體外和體內(nèi)的傳播受到一定影響，但并沒有完全消除［15］，表明真核細胞的其他受體或組件可能介導鮑曼不動桿菌的入侵和傳播。

3.2 非生物表面

3.2.1 PNAG PNAG 是大部分革蘭陰性菌細胞外基質(zhì)的主要成分，其生成由細菌染色體上pgaABC 基因序列編碼和調(diào)控［27］。PNAG 是鮑曼不動桿菌生物膜的重要組成部分。鮑曼不動桿菌含有pgaABCD 基因位點，該基因位點編碼參與合成PNAG 的蛋白質(zhì)。靜態(tài)條件下生物膜的形成，PNAG 不是必不可少的，但可能在動態(tài)和緊張的環(huán)境中，如高剪切力環(huán)境下，PNAG 對鮑曼不動桿菌的生物膜起到維持其完整性的作用［28］。

3.2.2 核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）T2家族蛋白 RNase T2家族蛋白可以調(diào)控鮑曼不動桿菌與非生物表面結(jié)合、生物膜的形成和細胞運動，但其確切生化作用還不明確。研究發(fā)現(xiàn)，RNase T2 家族蛋白功能的喪失與涉及生物膜形成以及細胞運動的幾個基因表達下降有關(guān)。突變體菌株RNaseT2家族蛋白（鮑曼不動桿菌ATCC17978 基因位點A1S＿3026）的編碼區(qū)被插入的轉(zhuǎn)座子所干擾，該菌株對聚苯乙烯、聚氯乙烯、玻璃和不銹鋼表面的定植與親本菌株相比顯著減少［3］。

3.2.3 環(huán)境因素 介質(zhì)的溫度、pH 值和鹽濃度等因素可以影響到生物膜的形成。研究表明，在30℃，pH 值6.0～7.0，鹽濃度為5.0g／L 的環(huán)境中，鮑曼不動桿菌形成生物膜的能力最強［22］。

3.2.4 物體表面粗糙度 物體表面的粗糙程度也對黏附性有影響。有研究證實，粗糙的不銹鋼表面與扁平或拋光的表面相比，極大地增強了細菌的黏附性和生物膜的形成［29］。醫(yī)院通過增加使用抵抗微生物定植的拋光材料，可以使醫(yī)院感染的機會減少［21］。

4 結(jié)語

鮑曼不動桿菌與非生物表面以及人類宿主細胞表面黏附的分子機制尚未清楚?，F(xiàn)在看來，細菌在非生物表面與生物表面存在許多共同點，但有明顯區(qū)別：細菌得以黏附在非生物表面上并長期存在主要是由生物膜提供保證，如菌毛、細菌表面蛋白和調(diào)控系統(tǒng)以及外界環(huán)境因素等參與了生物膜形成這一過程的啟動、發(fā)展、成熟及維護；細菌對于生物表面的黏附同樣是由菌毛以及細胞表面的多種蛋白，如Omps、Bap、Ata所介導，并受某些調(diào)控系統(tǒng)、細胞外二價陽離子濃度所影響。

總之，從鮑曼不動桿菌的黏附性入手，將上述眾多黏附相關(guān)因素從醫(yī)療器械以及人類宿主細胞表面上清除，并削弱其長期在醫(yī)院內(nèi)和患者體內(nèi)生存的能力，也許能為尋找新的治療措施提供思路，控制鮑曼不動桿菌的感染。

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