小瞼裂綜合征家系FOXL2基因突變檢測分析

陳琳琳 鄭穎潔 喬 潔 宋懷東 范先群▲.沈陽市第四人民醫(yī)院，遼寧沈陽 00；.上海愛爾眼科醫(yī)院，上海 00050；.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 000；.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，上海 0005

小瞼裂綜合征家系FOXL2基因突變檢測分析

陳琳琳1鄭穎潔2喬 潔3宋懷東4范先群3▲
1.沈陽市第四人民醫(yī)院，遼寧沈陽 110031；2.上海愛爾眼科醫(yī)院，上海 200050；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，上海 200025

目的探討小瞼裂綜合征（BPES）遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，確定BPES家系臨床表型，檢測FOXL2基因突變位點(diǎn)。方法收集并追溯調(diào)查BPES大家系全體家系成員，對其進(jìn)行全面體格檢查及眼部?？茩z查；對已收集到的BPES家系中全部患者按照眼科分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診、分型，即遺傳學(xué)的表型確定；所有現(xiàn)存家系成員性激素水平及卵巢功能檢測（女性），女性患者行腹部B超檢查，BEPS伴卵巢早衰（POF）患者行人體絨膜促性腺激素（HCG）興奮試驗(yàn)。全體家系成員取外周血5 mL，常規(guī)提取DNA，純化后的PCR產(chǎn)物送測序。 結(jié)果該家系共24人，現(xiàn)存17人，其中BPES患者7例，現(xiàn)存6例BPES患者中，女性患者均存在生殖異常，為BEPSⅠ型，進(jìn)一步完善該家系全部成員的體格檢查及女性患者卵巢功能檢查、人絨毛膜促性腺激素興奮試驗(yàn)、血清學(xué)檢查結(jié)果，支持POF的臨床診斷?；驕y序檢測到FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密碼）。 結(jié)論系譜分析表明該家系遺傳方式為常染色體顯性遺傳，常染色體顯性BPES存在遺傳異質(zhì)性，同一家系中不同個體間也有不同；基因測序檢測到的FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密碼）突變?yōu)樾碌耐蛔兾稽c(diǎn)。

小瞼裂綜合征；FOXL2基因；基因突變

小瞼裂綜合征（blephar-ophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome，BPES）是較為常見的眼病之一，是一種常染色體顯性遺傳病，其表現(xiàn)為雙眼上瞼下垂、瞼裂狹小、倒向性內(nèi)眥贅皮、內(nèi)眥間距增寬，常可伴有下眶緣發(fā)育不全和下瞼外翻。Vignes將其臨床上分為兩個表型：Ⅰ型外顯率為100%，由男性患者遺傳給下一代，下一代男女均可發(fā)病，臨床除BPES、顱面部發(fā)育不全表現(xiàn)外，女性患者還表現(xiàn)為不孕，原發(fā)性閉經(jīng)或提前閉經(jīng)、小子宮和卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF），而男性患者生育功能正常；Ⅱ型外顯率約為96.5%，只表現(xiàn)BPES體征而無性別差異且男女無生育功能障礙[1]。曾有多項(xiàng)研究報道1例BPES女性患者發(fā)展成為子宮內(nèi)膜癌[2-3]。本研究對自2007年開始收集的家系中一BPES（Ⅰ）型大家系進(jìn)行臨床遺傳學(xué)分析，并對其突變基因進(jìn)行檢測。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2007年9月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科確診的1個BPES大家系，追溯調(diào)查該家系成員共計(jì)24名，現(xiàn)存17名，患者7例，現(xiàn)存6例。以上所有家系成員均否認(rèn)近親婚配，患者母親否認(rèn)孕期用藥及患病史，所有患者均否認(rèn)早產(chǎn)史。參與研究者均經(jīng)知情同意并自愿參與本次研究。本次研究起止時間為2007年9月～2012年12月。

1.2 主要設(shè)備及試劑

直接檢驗(yàn)鏡（德國舌牌）、手持裂隙燈（德國舌牌）、乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的VACUETTER型真空抗凝采血管（Greiner bio-one公司）、ACD抗凝劑、1 mol/L的Tris-HCL緩沖液 （pH 8.0）、5 mol/L的EDTA溶液（pH 8.0）、TE緩沖液（pH 8.0）紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白酶K液（20 mg/mL）、苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）、10%十二烷基磺酸鈉（SDS）、480型熱循環(huán)儀 （Perkin-Elmer公司）、PCR產(chǎn)物回收柱（Qiagen，Promega公司）、水平式瓊脂糖電泳設(shè)備（上海精益有機(jī)玻璃加工廠）、TE緩沖液 （pH 7.6、8.0）、ABI 3730 DNA測序儀 （Applied Biosystems Perkin Elmer，F(xiàn)oster，CA）、割膠純化試劑盒（QIAGEN，Mississauga，Ontario，Canada）、分子量標(biāo)志物PCR Marker、Taq酶及其相關(guān)試劑（Promega公司）、瓊脂糖粉（中科院上海藥物研究所）、TBE緩沖液。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集

①嚴(yán)格按照國家和國際有關(guān)倫理學(xué)要求進(jìn)行家系收集，并對已收集到的BPES家系中所有患者按照眼科分型標(biāo)準(zhǔn)并參照McKusick《在線人類孟德爾遺傳》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）進(jìn)行確診、分型，即遺傳學(xué)的表型確定。②分析家系成員婚孕情況。③對所有家系成員進(jìn)行全面體格檢查，除外眼外疾患，眼部除上述表現(xiàn)外未見明顯異常。④女性患者均行腹部B超檢查。

1.3.2 性激素水平及卵巢功能檢測

黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、睪酮（T）、去氫表雄酮（DHEA-S）、17羥孕酮（17-OHP）和皮質(zhì)醇、醛固酮水平。

1.3.3 采用PCR檢測患者基因序列

采集現(xiàn)存6例家系成員外周血5 mL，加枸櫞酸鈉抗凝后，-20℃凍存?zhèn)溆谩３Ｒ?guī)DNA提取，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.1 基因組DNA的提取 抗凝血10 mL加入50 mL的塑料離心管中，加30 mL預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，冰浴10 min，4℃4000 r/min離心10 min，棄上清；加30 mL預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，冰浴10 min，4℃下4000 r/min離心10 min；加入100 μL預(yù)熱的20%SDS，40 μL的蛋白酶K，45℃過夜消化，80～100次/min輕輕振蕩；離心10 min后，取上清；用等體積酚-氯仿-異戊醇抽提1次；在上清中加入0.1 mL的醋酸鈉，2倍體積的無水乙醇（-20℃預(yù)冷），上下顛倒，直至析出絮狀沉淀；用玻璃棒挑出沉淀，裝入事先加有100%乙醇的1.5 mL的Eppendorf管中，13 000 r/min離心20 min，洗滌，棄乙醇，沉淀，自然干燥30 min，用TE溶解500 μL。待DNA在室溫下完全溶解后，吸出1 μL，溶解于99 μL ddH2O中，用0.1 mL的雙蒸水作為空白管，用紫外分光光度儀分別檢測260 nm和280 nm的吸光度（OD值）。最后，進(jìn)行DNA純度和質(zhì)量的鑒定，DNA濃度=波長260 nm處讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 PCR反應(yīng) Primer AB：PrimerA及PrimerB各0.5 μL（表1）、DNA模板1.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、Taq酶 0.5 μL、ddH2O加至 20 μL；Primer ab、cd：Qsolution 4.0 μL、Primer a/c 0.5 μL、Primer b/d 0.5 μL、DNA模板 1.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O加至20 μL。PCR循環(huán)在Perking-Elson 480型DNA熱循環(huán)儀上完成PCR循環(huán)。PCR反應(yīng)條件：Primer AB：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。Primer ab、cd：未加Taq酶：95℃預(yù)變性5 min，80℃變性10 min。加Taq酶：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、56℃退火40 s、72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察經(jīng)溴乙錠染色的凝膠，可見所需長度的單一特異片段。在Model PROTENⅡXi Cell型電泳儀（Bio-Rad公司）上電泳，使用冷循環(huán)將電泳溫度控制在20℃以下，所用電壓為120～150 V，依據(jù)DNA片斷的長度調(diào)整電泳時間，15～20 min。

1.3.3.3 PCR產(chǎn)物割膠純化 PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后可見單一特異條帶，符合此外顯子長度片斷；從凝膠中回收提純PCR產(chǎn)物：使用清潔無菌的手術(shù)刀片切下所需條帶，稱重；加入3倍體積的QG緩沖液，50℃溫育10 min，每2～3分鐘搖蕩，使膠充分溶解；再加入1倍體積的異丙醇混勻；將其注入下套2 mL收集管的純化試劑盒柱中，13 000 r/min離心1 min；棄流出液，加入0.5 mL的QG，離心1 min；棄流出液，加入0.75 mL的PE緩沖液再離心1 min；棄流出液，13 000 r/min離心1 min；柱下方套清潔的1.5 mL的離心管，13 000 r/min離心1 min；待DNA溶解后，再取2 μL電泳，確定濃度。

1.3.3.4 測序 純化后的PCR產(chǎn)物測序由國家人類基因組南方研究中心完成。

1.3.4 人體絨膜促性腺激素（HCG）興奮試驗(yàn)

對BPES伴POF患者行HCG興奮試驗(yàn)，早晨8：00采集患者空腹（基礎(chǔ)）促凝血5 mL，于采血后立即注射HCG注射液1500 U，分別于注射后24、48、72 h采集空腹促凝血5 mL，分別檢測各時段FSH、LH、PRL、E2、P、T、DHEA、17-OHP。

2 結(jié)果

2.1 BPES大家系全體家系成員臨床資料及遺傳情況分析

共有家系成員24名，現(xiàn)存17名，BPES患者7例?，F(xiàn)存的6例BPES患者中，男1例，女5例，男性患者生育正常，女性患者均未生育，并均于20歲左右開始出現(xiàn)月經(jīng)異常，其中2例患者已行子宮切除術(shù)。家系系譜表明BPES在傳代中連續(xù)相傳，且男女發(fā)病風(fēng)險相同，故這些家系均為常染色體顯性遺傳，見圖1。

2.2 先證者一般資料及臨床檢查情況

女，20歲，曾于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行腹部B超檢查示（圖2）：子宮前傾，前后徑2.7 cm，子宮內(nèi)膜厚0.3 cm，肌層回聲均勻。左卵巢2.5 cm×1.5 cm；右卵巢2.50 cm× 1.35 cm，雙卵巢未見確切發(fā)育卵泡，可見小卵泡約0.25 cm×0.30 cm。提示：①子宮未見確切異常；②雙卵巢未見發(fā)育卵泡。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院性激素檢測報告示：E2：163.0 pg/mL，P：0.49 ng/mL。

2.3 體格檢查及卵巢功能檢查、HCG興奮試驗(yàn)結(jié)果比較

該家系為BEPSⅠ型，進(jìn)一步完善該家系全部成員的體格檢查（圖3），對第三代的2例患者（Ⅲ5、Ⅲ13）及第四代的1例女性患者（Ⅳ2）血清學(xué)檢查及女性患者進(jìn)行卵巢功能檢查結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3例女性患者基礎(chǔ)E2降低而FSH（卵泡期血中FSH正常值為5.2～14.4 mU/L、LH（正常值：1.8～7.4 mU/L）升高，尤其FSH≥40 mU/L時，提示POF，見表2。HCG興奮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅲ5、Ⅲ13、Ⅳ2患者HCG注射24、48 h后，激素水平無明顯升高，提示POF，見表3。

2.4 突變檢測結(jié)果

基因測序檢測到FOXL2基因：C.429C＞A（提前的中止密碼），見圖4。

3 討論

BPES作為一種少見的遺傳性疾病最早在1889年由Vignes報道，Matsuoka等[3]曾經(jīng)報道1例女性BPES患者罹患子宮內(nèi)膜癌，與POF相關(guān)的閉經(jīng)是患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險因素。BPESⅠ型的女性患者如發(fā)生月經(jīng)改變應(yīng)該進(jìn)行定期的婦科檢查。基礎(chǔ)E2水平降低而FSH，LH升高，尤其FSH≥40 mU/L時，提示POF。FOXL2基因是單外顯子基因，長約2.7 kb，編碼376個氨基酸，含有兩個功能域，分別為101個氨基酸的DNA結(jié)合域和有14個保守殘基的多聚丙氨酸序列。FOXL2是一個假定編碼了一個叉頭結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，位于3q23（MIM#605597），其突變可導(dǎo)致兩種類型的BPES（BPES；MIM#110100），是一種常染色體顯性遺傳性疾病[5]。細(xì)胞遺傳學(xué)研究已證明BPES是由3q23的FOXL2基因突變所引起。除了FOXL2基因以外，還有一些叉頭基因如FOXE1、FOXC1、FOXC2及FOXP3，他們都與遺傳性疾病有關(guān)，其中兩個可發(fā)生眼部異常[4]。

起初有學(xué)者提出FOXL2的單倍劑量不足與BPES的形成有關(guān)，并揭示了起初的基因型與表型的關(guān)系[5-7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)兩種類型之間存在表型的交錯，并提出在一部分BPES患者中，基因缺陷并沒有位于FOXL2的編碼區(qū)內(nèi)，但卻產(chǎn)生了位置效應(yīng)[7]。后來的研究揭示了兩種突變熱點(diǎn)的存在，證明了家系內(nèi)和家系間的表型變異性，同時提示人們要用一種分子學(xué)的檢測手段來在少數(shù)的突變患者中預(yù)測POF的發(fā)生風(fēng)險[8]。

迄今為止，在全球內(nèi)報道過的206個不同種族的BPES家系中共發(fā)現(xiàn)有106個特征性的FOXL2基因內(nèi)突變[9-18]。所有的突變都發(fā)生在基因的編碼區(qū)內(nèi)，其中錯義突變占11%，無義突變占12%，移碼突變占44%，讀碼框內(nèi)改變占33%[7-8]。

本研究在此家系中發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)樾碌幕蛲蛔儯涔δ苡写M(jìn)一步研究。

[1]Zlotogora J，Sagi M，Cohen T.The blepharophimosis，ptosis and epicanthus inversus syndrome：delineation oftwo types[J].Am J Hum Genet，1983，35（5）：1020-1027.

[2]Stromme P，Sandboe F.Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome（BPES）[J].Acta Ophthalmol Scand，1996，74（1）：45-47.

[3]Matsuoka Y，Shibuya Y.Endometrial carcinoma in a patient with blepharophimosis syndrome and menstrual abnormality[J].Am J Ophthalmol，1997，124：855-856.

[4]Prueitt RL，Zinn AR.A fork in the road to fertility[J].Nat Genet，2001，27（2）：132-134.

[5]Crisponi L，Deiana M，Loi A，et al.The putative forkhead transcription factor FOXL2 is mutated in blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome [J].Nat Genet，2001，27（2）：159-166.

[6]Heinisch U，Zlotogora J，Kafert S，et al.Multiple mutations are responsible for the high frequency of metachromatic leukodystrophy in a small geographic area [J].Am J Hum Genet，1995，56（1）：51-57.

[7]De Baere E，Dixon MJ，Small K，et al.Spectrum of FOXL2 gene mutations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus（BPES）families demonstrates a genotype-phenotype correlation[J].Hum Mol Genet，2001，10（15）：1591-1600.

[8]De Baere E，Beysen D，Oley C，et al.FOXL2 and BPES：mutational hotspots，phenotypic variability，and revision of the genotype-phenotype correlation[J].Am J Hum Genet，2003，72（2）：478-487.

[9]Diane B，Jo V，Ludwine M，et al.The human FOXL2 mutation database[J].Human Mutation，2004，24（3）：189-193.

[10]Jiang HO，Huang XS，Su ZG，et al.Genetic analysis of the forkhead transcriptional factor 2 gene in three Chinese families with blepharophimosis syndrome [J].Molecular Vision，2013，19：418-423.

[11]Fan JY，Wang YF，Han B，et al.FOXL2 mutations in Chinese families with blepharophimosis syndrome（BPES）[J]. Transl Res，2011，157（1）：48-52.

[12]Cha SC，Jang YS，Lee JH，et al.Mutational analysis of forkhead transcriptional factor 2（FOXL2）in Korean patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Clin Genet，2003，64（6）：485-490.

[13]Crisponi L，Uda M，Chiappe F，et al.Genetic basis for nonsyndromic and syndromic，blepharophimosis/ptosis and epicanthus inversus syndrome（BPES）-associated premature ovarian failure（POF）[J].Am J Hum Genet，2002，71（Suppl）：324.

[14]Fokstuen S，Antonarakis SE，Blouin JL.FOXL2-mutations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome（BPES）：challenges for genetic counseling in female patients[J].Am J Med Genet，2003，117A（2）：143-146.

[15]Kosaki K，Ogata T，Kosaki R，et al.A novel mutation in the FOXL2 gene in a patient with blepharophimosis syndrome：differential role of the polyalanine tract in the developmentoftheovaryandtheeyelid[J].OphthalmicGenet，2002，23（1）：43-47.

[16]Kumar A，Babu M，Raghunath A，et al.Genetic analysis of a five generation Indian family with BPES：a novel missense mutation（p.Y215C）[J].Mol Vis，2004，10：445-449.

[17] Or SF，TongMF，Lo FM，et al.Three novel FOXL2 gene mutations in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chin Med J（Engl），2006，119（1）：49-52.

[18]TangS，WangX，LinL，etal.MutationanalysisoftheFOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosisepicanthus inversus syndrome[J].Mutagenesis，2006，21（1）：35-39.

Mutation analysis of FOXL2 gene in a Chinese family with Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome

CHEN Linlin1ZHENG Yingjie2QIAO Jie3SONG Huaidong4FAN Xianqun3▲
1.The Forth Hospital of Shenyang,Liaoning Province,Shenyang 110031,China;2.Aier Eye Hospital of Shanghai, Shanghai 200050,China;3.Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;4.Institute of Endocrinology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

ObjectiveTo investigate the pathogenesis of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome(BPES), and confirm the clinical phenotype of this family with BPESⅠand find the mutation of FOXL2 gene.Methods BPES family were collected and researched directly,and the pedigree was sketched.Strict ophthalmic examination was given to all the family members.All the examination results were collected and analyzed digitally.They were detected with sex hormone level and ovary function(female).The female patients were detected with B ultrasonic examination on abdomen.The female BPES patients with POF were detected by HCG stimulation test.5 mL peripheral blood was collected from the proband and the members of the family.Genomic DNA of the peripheral blood from each of the family members was extracted with routine phenol-chloroform method.After purification of PCR production,all the DNA sequences were automatically determined with double deoxidation termination method commercially.The mutation detection was applied to the family members.Results Retrospective survey was made for 24 members from this BPES family, among whom 7 cases were BPES patients and direct survey was made for 17 living members,among whom 6 cases were alive,all female suffered from reproductive abnormalities,were the BEPS type I.Further improved the physical examination of all the family members,ovarian function,HCG excited tests of women,serological test results,all these results supported the clinical diagnosis of POF.FOXL2: C.429C＞A (an untimely terminal code)was detected by gene sequencing.Conclusion The inheritance mode of BPES is autosomal dominant inheritance;the clinical presentation (phenotype)of BPES varied in different individual cases;new gene mutations are found in this family:C.429C＞A,an untimely terminal code.

BPES;FOXL2 gene;Gene mutation

R777.1

A

1673-7210（2015）03（c）-0017-05

2014-12-20本文編輯：任 念）

中國博士后基金項(xiàng)目；遼寧省百千萬人才專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目。

陳琳琳（1972.5-），女，博士，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼整形博士后，美國邁阿密大學(xué)Bascom Palmer眼科研究所訪問學(xué)者，中國中西醫(yī)結(jié)合眼科分會淚器病學(xué)組委員，主要從事眼整形、眼眶病、淚道系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。

▲通訊作者