粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)輻射誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞遠(yuǎn)期損傷的作用及其基因芯片分析

黃 頌 邢永華 張俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟愛(ài)民北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192

粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)輻射誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞遠(yuǎn)期損傷的作用及其基因芯片分析

黃 頌 邢永華 張俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟愛(ài)民
北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192

目的研究粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）對(duì)輻射誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）遠(yuǎn)期損傷的作用及其可能分子機(jī)制。 方法將30只SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠均分為對(duì)照組、6 Gy照射組、6 Gy照射+G-CSF組。獲取各組小鼠MSCs細(xì)胞后進(jìn)行全基因表達(dá)基因芯片分析。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體功能分類分析，并在京都基因和基因組百科全書(shū)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行通路富集分析。 結(jié)果經(jīng)6 Gy照射后小鼠MSCs中表達(dá)上調(diào)最顯著的20個(gè)基因中，有12個(gè)基因在6 Gy+G-CSF組小鼠MSCs中表達(dá)下調(diào)（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。經(jīng)6 Gy照射后小鼠MSCs中表達(dá)下調(diào)的所有基因中，有10個(gè)基因在6 Gy+G-CSF組小鼠MSCs中的表達(dá)上調(diào)（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。以上基因主要富集在細(xì)胞因子及其受體間相互作用通路、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路中。 結(jié)論 G-CSF可能對(duì)輻射誘導(dǎo)MSCs遠(yuǎn)期損傷有修復(fù)作用，其分子機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞分化及促進(jìn)免疫應(yīng)答有關(guān)。

G-CSF；間充質(zhì)干細(xì)胞；輻射；基因芯片

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）最早發(fā)現(xiàn)于骨髓的非造血系，是一類具有自我更新、多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞。MSCs不僅能夠支持造血、調(diào)節(jié)免疫功能，當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，MSCs還會(huì)靶向遷移至受損組織和炎性反應(yīng)位點(diǎn)，參與機(jī)體的損傷修復(fù)過(guò)程[1]。當(dāng)MSCs受到電離輻射后，其細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，ROS過(guò)量生成并在細(xì)胞內(nèi)積聚，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致MSCs自我更新和多向分化功能受到損傷，以致機(jī)體受損時(shí)不能及時(shí)進(jìn)行修復(fù)，甚至腫瘤發(fā)生[2]。

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是臨床用于救治輻射損傷的重要造血細(xì)胞因子，具有動(dòng)員骨髓和外周血中MSCs的功能，能使骨髓和外周血中MSCs的數(shù)量顯著增多[3-4]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究利用小鼠全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)接受全身照射小鼠骨髓MSCs的基因表達(dá)進(jìn)行分析，觀察輻射對(duì)受照小鼠MSCs基因表達(dá)的遠(yuǎn)期影響以及應(yīng)用G-CSF治療對(duì)受照小鼠MSCs基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自于Gibco公司（USA）；重組人粒細(xì)胞刺激因子購(gòu)自于杭州九源基因工程有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自于Thermo Scientific公司；137Csγ射線輻射源、USD Autocell40購(gòu)自于加拿大原子能有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠30只，18～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0017，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、6 Gy照射組、6 Gy照射+G-CSF組，每組10只小鼠。用137Csγ射線輻射源以1 Gy/min的劑量率，對(duì)6 Gy照射組和6 Gy照射+G-CSF組小鼠進(jìn)行6 min照射，以達(dá)到6 Gy的照射劑量。對(duì)三組小鼠進(jìn)行灌胃給藥。對(duì)照組每只小鼠給予200 μL生理鹽水，每日兩次；6 Gy照射組每只小鼠給予200 μL生理鹽水，每日兩次；6 Gy照射+G-CSF組每只小鼠給予G-CSF藥液200 μL（1 μg G-CSF/200 μL生理鹽水），每日兩次。照射當(dāng)日分別于照射后2、6 h給藥，照射后連續(xù)給藥6 d，共給藥14次。

1.3.2 小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取 照射后2個(gè)月取材，無(wú)菌分離小鼠雙側(cè)股骨脛骨，參照文獻(xiàn)中的方法分離培養(yǎng)MSC細(xì)胞[5]。在37℃，5%CO2的孵箱培養(yǎng)5 d后收集各組MSC細(xì)胞。

1.3.3 RNA處理及小鼠全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)MSC細(xì)胞加入Trizol后送交上?？党缮锕具M(jìn)行基因芯片的操作分析。主要步驟包括：①RNA提取及濃度的檢測(cè)后，用InvitrogenTMSuperScriptR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。②使用NimbleGen One-Color DNA標(biāo)記試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行標(biāo)記，然后利用NimbleGen雜交系統(tǒng)進(jìn)行雜交反應(yīng)。③NimbleGen Wash Buffer試劑盒洗凈后，用Axon GenePix 4000B掃描儀進(jìn)行掃描。將掃描后得到的TIFF格式圖像導(dǎo)入NimbleScan軟件（2.5版本）進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)分析。④表達(dá)數(shù)據(jù)通過(guò)NimbleGen軟件包含的四分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和Robust Multichip Average（RMA）算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，將所有基因水平的文件導(dǎo)入Agilent GeneSpring GX軟件（11.5.1版本）進(jìn)行進(jìn)一步分析。本研究中，以表達(dá)倍數(shù)的變化程度（≥1.5倍）確定差異表達(dá)的基因，無(wú)監(jiān)督層次聚類則利用 Agilent GeneSpring GX軟件（11.5.1版本）進(jìn)行。

1.3.4 GO功能分類及通路富集分析 利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）軟件對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能分類分析，并依據(jù)京都基因和基因組百科全書(shū)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

本研究采用的基因芯片為Roche NimbleGen公司的小鼠12×135K全基因組表達(dá)譜芯片，包含源于NCBI及其他權(quán)威數(shù)據(jù)來(lái)源的共約44 170個(gè)基因。研究結(jié)果顯示，6 Gy照射組小鼠的MSCs基因表達(dá)與對(duì)照組相比發(fā)生了明顯的變化，基因芯片分析有意義上調(diào)基因中差異最顯著的前 20個(gè)分別為 Vangl1、Limk1、L1cam、Cks1b、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Cks2、Mapk8、Afp、Lep、Ntn3、Ccnb1、Prickle1、Ccna2、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。這些基因表達(dá)上調(diào)的倍數(shù)為3.16～75.91倍（圖1）。分析6 Gy照射+G-CSF組小鼠MSCs的基因芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，以上20個(gè)基因中，有12個(gè)基因在給予G-CSF后表達(dá)下調(diào)，分別為Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。這些基因在給予G-CSF后表達(dá)下調(diào)倍數(shù)為2.06～77.94倍（圖2）。在這12個(gè)下調(diào)基因中，Vangl1、L1cam、Id1、Itgb3在6 Gy照射后+G-CSF組中的表達(dá)恢復(fù)正常（圖3）。而在6 Gy照射組與對(duì)照組小鼠MSCs基因芯片分析得出的有意義下調(diào)基因中，有10個(gè)在6 Gy照射后給予G-CSF組中表達(dá)上調(diào)，分別為 Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm（圖2）。在此10個(gè)基因中，Ccl19、Ccl21a、Tnnt2在6 Gy照射+G-CSF組中表達(dá)恢復(fù)正常（圖4）。

將上述差異表達(dá)基因利用KEGG生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，以DAVID軟件進(jìn)行通路富集分析后結(jié)果如表1所示。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞由于具有修復(fù)多種組織損傷的功能，現(xiàn)在已成為許多研究的熱點(diǎn)，并被廣泛應(yīng)用于臨床的細(xì)胞治療[6-7]。MSCs不僅具有易于獲取、增殖和分化能力強(qiáng)、適宜同種異體移植等優(yōu)勢(shì)[8]，而且還能分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子，這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子進(jìn)一步使MSCs具有調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力[6，9]。另外，由于一些分子信號(hào)通路的激活使細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)，因此MSCs具有向輻射誘導(dǎo)損傷位點(diǎn)靶向遷移并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)的能力[10]。MSCs具有支持骨髓造血的功能，且具有一定程度的輻射抗性，因此可修復(fù)輻射對(duì)骨髓基質(zhì)和造血微環(huán)境的損傷，有利于造血重建[11]。輻射誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞周期阻滯，克隆形成能力下降，細(xì)胞內(nèi)ROS積聚增多，并導(dǎo)致MSCs的DNA和干性受損[2，10]。GCSF作為臨床治療輻射暴露患者的首選藥物，能夠有效地動(dòng)員MSCs增殖及釋放細(xì)胞因子[12]。為了探討GCSF對(duì)輻射誘導(dǎo)MSCs遠(yuǎn)期損傷的作用及其可能的分子機(jī)制，本研究采用基因芯片的方法對(duì)照射后給予G-CSF小鼠的MSCs基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。

基因芯片的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，在6 Gy照射組小鼠MSCs中表達(dá)上調(diào)最顯著的20個(gè)基因中，有12個(gè)基因其在6 Gy照射+G-CSF組小鼠MSCs中的表達(dá)下調(diào)（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。另外，與正常對(duì)照組比較，在6 Gy照射組小鼠MSCs中表達(dá)下調(diào)的基因中，有10個(gè)基因其在6 Gy照射+GCSF組小鼠 MSCs中的表達(dá)上調(diào)（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。這些基因在功能上主要調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，細(xì)胞增殖與代謝，細(xì)胞周期和凋亡。通過(guò)對(duì)以上差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在細(xì)胞因子及其受體間相互作用通路（Ccl19、Ccl21a、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、G6pc2、Ikbkg、Acaca、Oxsm）、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路（Hdac2、Ccnb1、Mad1l1、Ikbkg）、PI3K-Akt信號(hào)通路（G6pc2、Igf1、Ifna6、Ikbkg、Itgb3、L1cam）、NF-κB信號(hào)通路（Ccl19、Ccl21a、Ikbkg）、p53信號(hào)通路（Ccnb1、Rrm2）中。綜合文獻(xiàn)報(bào)道和基因芯片的生物信息學(xué)分析結(jié)果，L1CAM可以結(jié)合到酪氨酸激酶受體（RTKs）及整合蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）活化，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)血管生成和通過(guò)激活磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。MAD1L1不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞在分化過(guò)程中退出細(xì)胞周期從而抑制細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。ITGB3作為整合素家族的一員，通過(guò)PI3K通路對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活均有調(diào)節(jié)作用[15]。ID1可以通過(guò)與堿性促黃體激素蛋白結(jié)合而抑制細(xì)胞分化[16]。當(dāng)VANGL1表達(dá)受到抑制時(shí)，通過(guò)對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)可顯著減少肝癌細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡[17]。CCNB1調(diào)節(jié)細(xì)胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)換，且在腫瘤組織中普遍高表達(dá)，作為一種細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)節(jié)劑在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量是判斷腫瘤惡性程度高低的指標(biāo)之一[18-19]。IGF1可以通過(guò)減少G1期細(xì)胞數(shù)量，增加S期與G2～M期細(xì)胞來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[20]。白細(xì)胞介素-13（IL-13）是T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和B細(xì)胞功能以及抑制促炎癥細(xì)胞因子生成的作用[21]。CCL19、CCL21為重要的趨化因子配體，不僅能夠誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）的成熟和遷移，還能直接調(diào)節(jié)DCs啟動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答。CCL19和CCL21與趨化因子受體CCR7共同作用，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。

綜上所述，本研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在全身照射小鼠遠(yuǎn)期基因調(diào)節(jié)仍有顯著改變。提示G-CSF不僅對(duì)造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞有促進(jìn)增殖和動(dòng)員的功能，G-CSF可能對(duì)輻射造成的MSCs遠(yuǎn)期損傷有促進(jìn)修復(fù)和功能調(diào)節(jié)作用。其分子機(jī)制可能與下調(diào)L1cam、Mad1l1、Id1、Ccnb1等調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分化基因的表達(dá)從而增強(qiáng)MSCs增殖分化功能有關(guān)；或與上調(diào)Ccl19、Ccl21a、Il13等免疫相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。這一基因芯片的結(jié)果為探討G-CSF對(duì)輻射誘導(dǎo)小鼠MSCs遠(yuǎn)期損傷作用的分子機(jī)制提供了思路，反映了給予G-CSF后小鼠MSCs內(nèi)編碼這些蛋白質(zhì)的mRNA表達(dá)量的改變，但還需要有后期蛋白質(zhì)功能實(shí)驗(yàn)的支持，以及分子生物學(xué)方法驗(yàn)證這些基因調(diào)控的信號(hào)途徑。

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Microarray analysis and the effect of G-CSF on ionizing radiation induced long term mesenchymal stem cells injury

HUANG Song XING Yonghua ZHANG Junling LU Lu LI Chengcheng LI Deguan MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Tianjin 300192, China

ObjectiveTo study the effect of G-CSF on ionizing radiation (IR)induced long term mesenchymal stem cells (MSCs)injury and its possible molecular mechanisms.Methods 30 SPF C57BL/6 female mice were divided into control group,6 Gy irradiation Group,6 Gy irradiation+G-CSF administration group equally,RNA of mice's MSCs was extracted from the mice of three groups,and then biotin-labeled cDNA was generated by reverse transcription of mRNA for hybridization with Roche NimbleGen 12x135K mouse gene expression microarrays.The differentially expressed genes with 2-fold change were identified.Gene ontology enrichment analysis and pathway analysis based on Kyoto Encyclopedia of genes and genomes database were used to distribute the differentially expressed genes into biological processes and pathways.Results Among top 20 of up-regulated genes in 6 Gy group compared to control group, 12 genes were down-regulated in 6 Gy+G-CSF group (Vangl1,L1cam,Hdac2,Polk,Id1,Ttc37,Afp,Ccnb1,Ikbkg, Mad1l1,Itgb3,Rrm2).10 genes were up-regulated in 6 Gy+G-CSF group while down-regulated in 6 Gy group(Ccl19, Ccl21a,G6pc2,Igf1,Tnnt2,Ifna6,Tnfrsf14,Il13,Acaca,Oxsm).Pathway analysis based on KEGG database showed all the differentially expressed genes described above were mainly associated with cytokine-cytokine receptor interaction pathway,cell cycle and cell apoptosis regulation pathway,PI3K-Akt signaling pathway,NF-κB signaling pathway and p53 signaling pathway.Conclusion G-CSF may repair the IR-induced long term MSCs damage,and its molecular mechanisms may relate to regulation of cell cycle,inhibition of cell apoptosis,promotion of cell differentiation,or improve the immune response.Further researches are required to clarify the related signal transduction pathways.

G-CSF;MSCs;Radiation;Microarray

R329.2

A

1673-7210（2015）03（c）-0009-05

2014-12-20本文編輯：任 念）

國(guó)家自然科學(xué)基金海外合作基金項(xiàng)目 （編號(hào)81129020）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（“973”計(jì)劃）（編號(hào)2011CB964800-G）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)81372928）。

黃頌（1988.2-），女，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所2012級(jí)放射醫(yī)學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：放射醫(yī)學(xué)。

孟愛(ài)民（1963.4-），女，碩士，博士生導(dǎo)師；研究方向：造血免疫損傷及腫瘤治療領(lǐng)域的藥理毒理學(xué)研究。