潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)的建立及其應(yīng)用

林旋豪，王少洪，吳智勇，藍(lán)斌，李帆，肖坤勝，許秀娥，吳健誼，傅俊惠，章克毅，姚曉冬，范揚(yáng)航，鄭海波，鄭春鵬，李銳雄，黃建豪，張仕義，陳捷鑫，李卓毅，朱天翔，楊彥龍，張澤淳，杜澤森，黃崇植，林曉榕，許小超，趙麟，許麗艷，李恩民

·生物樣本庫(kù)建設(shè)·

潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)的建立及其應(yīng)用

林旋豪，王少洪，吳智勇，藍(lán)斌，李帆，肖坤勝，許秀娥，吳健誼，傅俊惠，章克毅，姚曉冬，范揚(yáng)航，鄭海波，鄭春鵬，李銳雄，黃建豪，張仕義，陳捷鑫，李卓毅，朱天翔，楊彥龍，張澤淳，杜澤森，黃崇植，林曉榕，許小超，趙麟，許麗艷，李恩民

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球常見(jiàn)八大惡性腫瘤之一，位居惡性腫瘤死亡率第六位［1-2］。依據(jù)組織病理類型分類，食管癌主要包括食管鱗癌和食管腺癌。食管鱗癌主要集中在亞洲的中東部和非洲等地區(qū)，而食管腺癌則在歐美等國(guó)家地區(qū)多發(fā)［3］。我國(guó)是世界上最主要的食管鱗癌高發(fā)國(guó)，食管鱗癌病例占全部食管癌病例的 90% 以上，并呈現(xiàn)明顯的地理性分布差異，主要分布在河北、河南和山西三省交界的太行山地區(qū)，閩粵交界的潮汕沿海地區(qū)，鄂皖交界的大別山地區(qū)，四川北部地區(qū)，新疆哈薩克族居民居住地區(qū)和蘇北地區(qū)等［4-5］。腫瘤流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，潮汕地區(qū)是我國(guó)唯一的沿海食管癌高發(fā)區(qū)，與我國(guó)其他內(nèi)陸型食管癌高發(fā)區(qū)相比，其地理位置與氣候條件，以及當(dāng)?shù)鼐用耧嬍成盍?xí)俗等均明顯不同。1995-2004年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，該地區(qū)食管癌的標(biāo)化發(fā)病率為 74.47/105［6-7］。在潮汕當(dāng)?shù)?，食管鱗癌的發(fā)病率一直高居各類惡性腫瘤之首。在此背景之下，毋庸置疑，建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)是十分重要的工作，對(duì)揭示食管癌，尤其是食管鱗癌的病因，闡明這種特殊惡性腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制，尋找其早期癌變特異性分子標(biāo)志物，以利于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，以及監(jiān)測(cè)治療后患者病情發(fā)展轉(zhuǎn)歸、預(yù)警預(yù)后等均有著十分重要的意義。

1 標(biāo)本收集

由于食管癌發(fā)病癥狀比較晚，大部分患者就診時(shí)已處于中晚期［8］，甚至部分患者就診時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)的目的是采集、保存和利用好該特色疾病資源，滿足醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的需要，同時(shí)以合作的方式為其他科研機(jī)構(gòu)的研究者提供食管癌樣本，共享疾病研究資源，促進(jìn)相關(guān)科學(xué)研究。

首先，我們建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)，是在國(guó)家863 重大專項(xiàng)基金的框架下實(shí)施的，其規(guī)則程序已經(jīng)過(guò)汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，食管癌樣本的收集過(guò)程接受汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督。其次，在專業(yè)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)之上，我們制定出食管癌組織，配對(duì)的食管癌旁組織與食管癌手術(shù)遠(yuǎn)端切緣相對(duì)正常食管上皮組織，以及食管癌患者活檢組織與血液標(biāo)本的收集計(jì)劃和使用規(guī)范。再次，上述所有生物標(biāo)本的采集均簽署《知情同意書(shū)》，在不額外增加患者痛苦和不影響臨床病理診斷的原則下進(jìn)行［9］。自 2007年11月，我們開(kāi)始收集在汕頭市中心醫(yī)院腫瘤外科和心胸外科確診的食管癌患者，手術(shù)切除的食管癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)端切緣相對(duì)正常食管上皮組織標(biāo)本，以及食管癌患者活檢組織，分別以液氮速凍和石蠟包埋的方式進(jìn)行處理。同時(shí)配對(duì)收集患者術(shù)前和術(shù)后血液標(biāo)本，分離血清、血漿和淋巴細(xì)胞，標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后保存于 -80 ℃ 超低溫冰箱。與此同時(shí)，通過(guò)生物樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)對(duì)上述各生物標(biāo)本及其相關(guān)信息進(jìn)行動(dòng)態(tài)管理。

截至 2015年11月9日，本食管癌樣本庫(kù)已經(jīng)收集石蠟組織標(biāo)本 3264 例，冰凍組織標(biāo)本 996 例，配套血液標(biāo)本 835 例。

2 標(biāo)本處理

在生物芯片上海國(guó)家工程研究中心的指導(dǎo)下，潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)已經(jīng)完成《汕頭市中心醫(yī)院——生物樣本庫(kù)規(guī)劃建設(shè)方案》和《汕頭市中心醫(yī)院——生物樣本庫(kù)SOP》兩份指南性文件［10-12］，制定了嚴(yán)格、規(guī)范的操作流程，并在操作過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)化程序。本食管癌樣本庫(kù)工作人員均參加了中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì)組織的樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，并獲得上崗證書(shū)。所有取材人員都經(jīng)過(guò)一年以上的病理取材培訓(xùn)，能夠在確保取材部位準(zhǔn)確性的前提下進(jìn)行快速規(guī)范地取材［13］。

⑴冰凍組織：分別選取切緣相對(duì)正常食管上皮組織、癌旁組織和食管癌組織，切割成 0.5 cm3的小組織塊裝管。

⑵石蠟組織：組織經(jīng)程序化固定、脫水和包埋后制作成石蠟塊，常溫保存。

⑶血液：非抗凝血和抗凝血各 1 管，5 ml，靜置 30 min后在 4 ℃ 條件下，1200 × g 離心 10 min，分離其血清、血漿和淋巴細(xì)胞。血清和血漿在 4 ℃，1800 × g 條件下進(jìn)行二次離心，離心 10 min 后分裝，分裝管數(shù)根據(jù)抽血量不同而各異，每管為 300 μl。

⑷速凍及保存：冰凍組織標(biāo)本和血液標(biāo)本分裝標(biāo)注后，經(jīng)液氮速凍 60 s，然后轉(zhuǎn)移到 -80 ℃ 超低溫冰箱進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

3 數(shù)據(jù)錄入與隨訪

本庫(kù)選用無(wú)錫市朗珈生物醫(yī)學(xué)工程有限公司開(kāi)發(fā)的生物樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)對(duì)入庫(kù)標(biāo)本進(jìn)行智能化管理，主要包括標(biāo)本信息、標(biāo)本相關(guān)信息和應(yīng)用信息等［14］。標(biāo)本信息如標(biāo)本編碼、取材處理、儲(chǔ)存記錄及質(zhì)量控制等信息；標(biāo)本相關(guān)信息如患者臨床信息和隨訪信息等；應(yīng)用信息如食管癌樣本使用者反饋的信息等。標(biāo)本的編碼和儲(chǔ)存位置由管理軟件分配生成，患者臨床信息通過(guò)電子病歷系統(tǒng)和病理質(zhì)控與資料管理系統(tǒng)提取生成。手工錄入的信息主要有生物標(biāo)本的取材處理信息如分裝管數(shù)、石蠟塊數(shù)量和標(biāo)本處理時(shí)間以及隨訪信息。潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)有專職工作人員從事患者的隨訪和數(shù)據(jù)庫(kù)更新，完善的隨訪信息有利于醫(yī)院臨床診療及醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)行。臨床醫(yī)師通過(guò)隨訪信息獲知治療結(jié)果，為評(píng)估臨床治療方案提供相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，有助于診療方案的完善和改進(jìn)；醫(yī)學(xué)科學(xué)研究通過(guò)總生存期及無(wú)病生存期的分析作為研究課題是否具有臨床意義的重要證據(jù)。

4 質(zhì)量控制

隨著功能基因組學(xué)和生物芯片技術(shù)研究的不斷深入，生物樣本的采集、儲(chǔ)存成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分，組織的取材是否具有代表性、保存標(biāo)本的質(zhì)量如何等都是需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，因此，建立質(zhì)量管理體系是建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量生物樣本庫(kù)的重要環(huán)節(jié)［15］?；跇?biāo)本編碼，潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)定期采用 Excel 軟件生成隨機(jī)數(shù)表的方式進(jìn)行抽樣檢測(cè)，抽取石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行 HE 染色，評(píng)估取材準(zhǔn)確性和腫瘤細(xì)胞占比；定期檢測(cè)食管鱗癌冰凍組織的 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的完整性，比例約為 2%［16］。

⑴儲(chǔ)存條件：本食管癌樣本庫(kù)配備了自動(dòng)化溫控監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，對(duì)室溫、超低溫冰箱和液氮罐進(jìn)行 24 h 持續(xù)監(jiān)控，監(jiān)測(cè)頻率為 30 min/次。

⑵腫瘤細(xì)胞比例：隨機(jī)抽取標(biāo)本，經(jīng)切片、蘇木素和伊紅染色后在鏡下評(píng)估腫瘤細(xì)胞的百分比，大于 80% 為良好，小于 65% 為不合格。

⑶核酸完整性：定期抽取標(biāo)本，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的豐度和純度，采用瓊脂糖電泳測(cè)定組織樣本的DNA 和 RNA 的完整性。

⑷蛋白質(zhì)完整性：定期抽取標(biāo)本，采用 Western blot 測(cè)定目標(biāo)蛋白的完整性。

⑸信息準(zhǔn)確度：對(duì)生物樣本信息進(jìn)行抽檢，檢查其完整性和準(zhǔn)確性。主要是檢查新入庫(kù)樣本的標(biāo)本信息和患者臨床信息是否完整，虛擬庫(kù)與實(shí)體庫(kù)的位置是否對(duì)應(yīng)等。通過(guò)系統(tǒng)查詢并打印存檔來(lái)校對(duì)和控制相關(guān)信息的完整性。

本食管癌樣本庫(kù)儲(chǔ)存的標(biāo)本經(jīng)組織學(xué)、分子生物學(xué)等質(zhì)量控制技術(shù)檢驗(yàn)顯示符合研究要求，可以支持各相關(guān)科學(xué)研究。

5 應(yīng)用

本潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)是汕頭市中心醫(yī)院和汕頭大學(xué)潮汕沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤分子生物學(xué)廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室）合作共建，主要為建庫(kù)雙方和其他合作單位提供資源進(jìn)行相關(guān)科學(xué)研究，樣本使用者必須具有一定的資質(zhì)，能妥善利用樣本資源。同時(shí)，要求使用者及時(shí)反饋樣本使用情況，包括生物標(biāo)本 DNA/RNA/蛋白質(zhì)量等基本質(zhì)量信息，也包括課題產(chǎn)生的部分特有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以利于生物樣本庫(kù)的改進(jìn)和不斷發(fā)展。

2007年以來(lái)，該特色生物樣本庫(kù)共支持各類科研項(xiàng)目累計(jì) 20 余項(xiàng)，主要包括國(guó)家 863 重大科研專項(xiàng) 3 項(xiàng)，NSFC-廣東聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目 2 項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 6 項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 6 項(xiàng)等，在Nature、Clin Cancer Res、J Pathology 等期刊雜志上發(fā)表 SCI收錄研究論文 30 余篇，累計(jì) SCI 影響因子大于 120。

6 小結(jié)

按照生物樣本庫(kù)建立規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，我們已成功建立了潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫(kù)，而且利用該特色生物樣本庫(kù)促進(jìn)相關(guān)科學(xué)研究成效顯著。

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國(guó)家 863 重大專項(xiàng)（2012AA02A209、2012AA02A503）

515051 汕頭市中心醫(yī)院病理科（林旋豪、王少洪、李帆、肖坤勝），腫瘤外科（吳智勇、傅俊惠、章克毅、姚曉冬、范揚(yáng)航、鄭海波、鄭春鵬、黃建豪、張仕義、陳捷鑫、李卓毅、張澤淳、杜澤森、黃崇植、林曉榕、許小超、趙麟），心胸外科（藍(lán)斌、李銳雄、朱天翔、楊彥龍）；515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室（許秀娥、吳健誼、李恩民），潮汕沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤分子生物學(xué)廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（吳健誼、許麗艷、李恩民）

王少洪，Email：w196303@sohu.com；吳智勇，Email：stwuzy@163.com；藍(lán)斌，Email：swatowdoctor@126.com

2015-11-19