流式細胞術(shù)在銀屑病研究中的應(yīng)用進展

劉漢清靳洪濤，2王愛平，2?

流式細胞術(shù)在銀屑病研究中的應(yīng)用進展

劉漢清1靳洪濤1，2王愛平1，2?

流式細胞術(shù)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)。本文就流式細胞術(shù)在銀屑病研究中的最新進展進行綜述。

銀屑病； 流式細胞術(shù)； 淋巴細胞

銀屑病是一種以表皮過度增殖伴角化不全及真皮淋巴細胞浸潤為特征的皮膚病，發(fā)病機制復(fù)雜，病程長，易復(fù)發(fā)，難治愈，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種新型、綜合性細胞分析技術(shù)，在銀屑病的研究中應(yīng)用較為廣泛，現(xiàn)對其進行綜述。

1　淋巴細胞分類和亞群測定

免疫異常是銀屑病主要發(fā)病機制之一。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，F(xiàn)CM進行T細胞亞群測定在銀屑病發(fā)病機制研究中應(yīng)用廣泛。如繆界萍1采用FCM測定發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CD4+細胞百分率及CD4+/CD8+比值均低于正常人；尚智偉等2采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CD8+T細胞數(shù)量高于正常人；董萍云等3采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CD4+CD25+細胞占T細胞比例明顯低于正常人；何榮國等4采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病外周血Th17細胞和Th17/Treg比例較正常人高，Treg細胞較正常人低。

采用FCM進行淋巴細胞亞群測定在銀屑病的臨床診斷中亦具有重要作用。銀屑病按其臨床表現(xiàn)可分為尋常型、膿皰型、紅皮病型、關(guān)節(jié)病型。韓凌等5采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)紅皮病型銀屑病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平明顯高于其他類型銀屑病患者和正常人。Benham等6采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)Th17、Th22細胞在尋常型和關(guān)節(jié)病型銀屑病患者和正常人外周血、滑液、滑膜中的細胞分布和頻率存在差異。紅皮病型銀屑病和 Sézary綜合征（Sézary Syndrome，SS）表現(xiàn)相似，易誤診，Nagler等7評估了應(yīng)用FCM檢測外周血特殊生物標記物在二者鑒別中的應(yīng)用和不足，認為 CD4+/CD8+比率，CD7、CD26和CD27表達異常等可作為二者鑒別診斷的參考。鄧田睿等8采用FCM檢測銀屑病患者臨床痊愈時外周血T細胞亞群的情況，發(fā)現(xiàn)患者CD4+T細胞較低者近期復(fù)發(fā)的可能性更大，提示FCM檢測T細胞亞群在監(jiān)測銀屑病的治療效果方面亦有一定作用。

FCM檢測淋巴細胞亞群在銀屑病治療藥物和方法研究中應(yīng)用廣泛。楊曉梅等9采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)他克莫司治療尋常型銀屑病的機制可能是調(diào)節(jié)患者CD4+CD25+Treg細胞水平；賀紅霞等10采用FCM觀察發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者外周血CD4+及CD4+/CD8+比值均低于正常人，CD8+高于正常參考值，而紫外線治療可改善銀屑病癥狀并使患者外周血T細胞亞群逐漸恢復(fù)正常。

由于百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積液體中的絕對數(shù)量，因而具有一定的局限性。隨著FCM的發(fā)展，目前已經(jīng)實現(xiàn)淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)。T細胞亞群絕對計數(shù)在國外實驗室早已成為常規(guī)檢查，但在國內(nèi)僅有少數(shù)實驗室開展?？梢灶A(yù)見，流式細胞絕對計數(shù)在銀屑病的研究中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

2　細胞鑒定及活化狀態(tài)研究

骨髓基質(zhì)細胞（bone Inarrow stromal cells，BMSC）是存在于骨髓中的一類成體干細胞，可直接影響造血干細胞的發(fā)育而參與銀屑病的發(fā)病。BMSC表面CD29表達為陽性，而CD34、CD45表達陰性。11近年來，原代培養(yǎng)的BMSC常被用于其參與銀屑病發(fā)病的機制研究，通常在分離培養(yǎng)后采用FCM檢測CD29、CD34、CD45的表達對其鑒定。12許多研究表明，淋巴細胞異?；罨赡軈⑴c銀屑病的發(fā)病，通過FCM檢測淋巴細胞活化標志可分析其活化狀態(tài)。共刺激分子CD28、CD80、CD86是決定T細胞激活的關(guān)鍵因素。CD80表達于活化的T細胞上，沈斌等13采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血T細胞表面CD80的表達高于正常人且進行期高于退行期。韓義香等14通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者CD28在CD4+細胞和CD8+細胞上的表達均較正常人增加，CD80和CD86在CD4+細胞上的表達較正常人增加。CD69是T細胞早期活化標志分子。

3　細胞表面受體檢測

趨化因子通過趨化因子受體對淋巴細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞等發(fā)揮趨化作用，從而在銀屑病的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮作用，目前關(guān)于CC趨化因子受體（chemokine C-C motif receptor，CCR）的研究較多。如劉海琴15采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者外周血T細胞CCR6表達率遠高于正常人；樊昕等16發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者皮損和外周血T細胞表面CCR7明顯高于正常人。

紅細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，研究表明銀屑病患者紅細胞I型補體受體（Complement Receptor，CR1）的表達高于正常人。CR1的特異性表面抗原為CD35，在進行FCM測定時，需用枸櫞酸鈉抗凝新鮮血樣與CD35單克隆抗體混合，樣本的處理方法與淋巴細胞測定時存在較大差別。17

Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）是天然免疫系統(tǒng)中的主要模式識別受體，CD14是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）受體復(fù)合物中的成員。LPS與CD14、TLR4等受體復(fù)合物結(jié)合后可激活信號傳導(dǎo)通路最終導(dǎo)致核因子（Nuclear Factor，NF）激活和炎癥因子釋放，參與銀屑病的發(fā)病過程。徐麗敏等18采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CDl4和TLR4的表達均高于對照組。羅權(quán)等19FCM檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CDl4+單核細胞TLR2、TLR4表達率均較正常人明顯增高且進行期高于靜止期，經(jīng)甲氨蝶呤治療后TLR2、TLR4的表達率明顯低于治療前，推測甲氨蝶呤能通過抑制TLR2、TLR4表達而發(fā)揮作用。

4　細胞因子和核因子定量分析

細胞因子是細胞被免疫原等刺激后所產(chǎn)生的一種低分子量、可溶性蛋白質(zhì)，包括白介素（IL）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）等，具有調(diào)節(jié)免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復(fù)等功能。NF-кB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)NF-кB信號通路，TNF、IL-1等細胞因子可激活NF-kB，活化的NF-kB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與其相關(guān)的DNA基序結(jié)合以誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。許多研究表明細胞因子和NF-kB信號通路在銀屑病的發(fā)病中具有重要作用。FCM可對多種細胞因子和 NF-кB進行定量分析。如陳潔等20采用FCM檢測不同癥候銀屑病患者CD4+T細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ、IL-17A的表達情況，發(fā)現(xiàn)血熱組銀屑病患者外周血CD4+IFN-γ+水平顯著高于血瘀組及正常人而各組間CD4+IL-17A+無顯著性差異。高軍等21將銀屑病患者外周單個核細胞（PBMC）和角化細胞（KC）進行混合培養(yǎng)，采用FCM檢測核轉(zhuǎn)NF-κB的表達，ELISA法測上清液IL-8含量，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者NF-κB表達及IL-8含量較正常人顯著上調(diào)，而雷公藤可下調(diào)NF-κB表達及IL-8含量。

除采用平均熒光強度或相對熒光強度進行的相對定量分析，隨著定量流式細胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）的發(fā)展，還可對細胞因子等進行絕對定量分析。QFCM定量分析主要有兩種：①定量抗體微球法：將包被不同IgG分子數(shù)的特制微球混合，然后與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體反應(yīng)并測定熒光強度，根據(jù)微球IgG分子數(shù)-熒光強度曲線和待測樣本陽性細胞的熒光強度計算待測樣本陽性細胞上的抗原分子數(shù)。②定量熒光素分子微球法：將包被不同熒光素分子數(shù)的微球混合后在相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度，根據(jù)微球熒光素分子數(shù)-熒光強度曲線和將待測樣本陽性細胞熒光強度，可求得待測樣本陽性細胞上的平均熒光素分子數(shù)，根據(jù)用于樣本測定的單克隆抗體與熒光素結(jié)合的分子比例，可計算每個細胞上的平均抗原分子數(shù)。如趙京霞等22為研究IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用采用定量抗體微球法檢測了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠血清細胞因子含量。

5　細胞周期和細胞凋亡測定

細胞周期和細胞凋亡測定是FCM最重要的應(yīng)用之一，一般采用FITC標記的膜聯(lián)蛋白（Annexin）-V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法測定。FCM檢測細胞周期和細胞凋亡在銀屑病研究中主要是用于治療藥物細胞水平的藥效學(xué)和機制研究，所用細胞系主要為傳代的角化細胞如人永生角質(zhì)形成細胞株HaCaT和角質(zhì)形成細胞株Colo-16。張曉杰等23采用FCM觀察了清熱利濕飲對HaCaT細胞周期的影響。段行武等24采用FCM檢測了消銀解毒飲及其拆方后的涼血、解毒和祛風(fēng)除濕等三組主要成份含藥血清對Colo-16凋亡的誘導(dǎo)作用。George等25運用FCM等技術(shù)研究了磷脂酰絲氨酸外在化等一系列細胞凋亡生物標記物，闡明了地蒽芬誘導(dǎo)角化細胞株HaCaT凋亡的劑量和時間依賴性。Li等26采用FCM等方法研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA劑量和時間依賴性抑制鼠角質(zhì)細胞擴散，誘導(dǎo)細胞凋亡，闡明了丹參酮IIA治療銀屑病的分子機制。

6　展望

FCM自20世紀70年代以來，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生物的多個領(lǐng)域。近年來，隨著檢測設(shè)備和技術(shù)的進步，F(xiàn)CM檢測的廣度和精確度有了長足發(fā)展。如流式微球分析技術(shù)使FCM從細胞檢測發(fā)展到細胞外檢測，從相對定量發(fā)展到絕對定量，檢測標本也擴展到血清、血漿、培養(yǎng)液上清、體液可溶性物質(zhì)體系，而且與傳統(tǒng)方法比較具有靈敏度高、重復(fù)性好、樣本用量少、檢測效率高等特點；流式分子表型分析技術(shù)可檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常；流式熒光原位雜交法可測定染色體端粒長度，能精度測定小于3Kb的端粒長度差；流式細胞分選技術(shù)可通過流動室噴口上的超高頻電晶體使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，然后將帶有不同的電荷的液滴流在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)落入各自的收集容器中，從而實現(xiàn)細胞的分離。相信隨著科技水平的進步，F(xiàn)CM將有進一步發(fā)展，并在銀屑病的研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

1繆界萍.尋常型銀屑病患者的外周血T淋巴細胞亞群和血清腫瘤壞死因子α的變化及臨床意義.中國醫(yī)藥指南，2010，1：12-13.

2尚智偉，李其林，李曉輝，等.173例尋常型銀屑病患者外周血T淋巴細胞亞群、免疫球蛋白及補體水平與PASI相關(guān)性分析.嶺南皮膚性病科雜志，2009，16（4）：228-231.

3董萍云，鄧愛兵，褚京津，等.尋常型銀屑病患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平的表達.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，12：1806-1809.

4何榮國，伍紹國，田華，等.尋常型銀屑病患者外周血Thl7/ Treg失衡的研究.中華皮膚科雜志，2011，44（6）：411-414.

5韓凌，黃瓊，方栩，等.銀屑病外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的表達.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2009，25（10）：722-724.

6 Benham H，Norris P，Goodall J，et al.Th17 and Th22 cells in psoriatic arthritis and psoriasis.Arthritis Res Ther，2013，15（5）：R136.

7 Nagler AR，Samimi S，Schaffer A，etal.Peripheral blood findings in erythrodermic patients：importance for the differential diagnosis of Sézary syndrome.JAm Acad Dermatol，2012，66（3）：503-508.

8鄧田睿，瞿幸.銀屑病愈后復(fù)發(fā)與外周血T淋巴細胞關(guān)系研究.中醫(yī)臨床研究，2011，3（20）：43-44.

9楊曉梅，何榮國.外用他克莫司對尋常型銀屑病患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞的影響.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2010，16（15）：1858-1861.

10賀紅霞，白莉，郭書萍.窄譜中波紫外線對尋常型銀屑病外周血T淋巴細胞亞群的影響.山西醫(yī)藥雜志，2010，39（11）：1005-1006.

11孟維維，田畔，張振穎，等.銀屑病骨髓間質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性.中華皮膚科雜志，2010，2：108-110.

12劉瑞風(fēng)，馮海燕，張靜，等.銀屑病患者骨髓基質(zhì)細胞生物學(xué)活性研究.臨床皮膚科雜志，2011，40（9）：540-542.

13沈斌，程浩，李凌，等.銀屑病患者外周血T淋巴細胞CD80的表達.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2005，21（7）：521-523.

14韓義香，楊毅，章圣輝，等.銀屑病患者外周血T細胞亞群及B7/CD28的表達.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2007，23（10）：908-909.

15劉海琴.窄譜中波紫外線對尋常型銀屑病患者外周血T細胞CCR6表達的影響.中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（11）：851-853.

16樊昕，王剛，劉玉峰.尋常型銀屑病患者趨化因子受體7表達及其意義探討.中國皮膚性病學(xué)雜志，2006，20（12）：724-726.

17許文，顧軍，郭峰，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡和銀屑病患者外周血細胞黏附功能與紅細胞表面及血小板CD35的活性研究.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2007，23（6）：485-488.

18徐麗敏，韓靜倩，趙宏麗，等.銀屑病患者外周血白細胞mCD14、TLR4和核因子-κB的表達.中華皮膚科雜志，2008，41（10）：689-691.

19羅權(quán)，林玲，李嘉彥，等.甲氨蝶呤對尋常型銀屑病患者外周血CDl4+單核細胞Toll樣受體2，4表達的影響.中華皮膚科雜志，2009，42（11）：760-762.

20陳潔，徐蓉，李欣，等.不同證候銀屑病患者外周血Thl/Thl7細胞表達差異的研究.中華皮膚科雜志，2013，46（3）：172-175.

21高軍，任萬明，張志鵬.雷公藤多甙對銀屑病患者NF-кB及細胞因子的影響.西部中醫(yī)院，2013，26（9）：26-28.

22趙京霞，底婷婷，王燕，等.IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用.中國病理生理雜志，2013，29（6）：1086-1094.

23張曉杰，孫淑娜，魯娟娟，等.清熱利濕飲對HaCaT細胞增殖的影響.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2013，29（1）：3-5.

24段行武，趙立軍，張霞，等.消銀解毒飲及拆方對角質(zhì)形成細胞COLO-16凋亡的調(diào)控作用.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2010，26（4）：256-258.

25George SE，Anderson RJ，Haswell M，et al.An investigation of the effects of dithranol-induced apoptosis in a human keratinocyte cell line.JPharm Pharmacol，2013，65（4）：552-560.

26 Li FL，Xu R，Zeng QC，et al.Tanshinone IIA inhibits growth of keratinocytes through cell cycle arrest and apoptosis：Underlying treatmentmechanism of psoriasis.Evid Based Complement AlternatMed，2012，2012：927658.

（收稿：2014-05-06 修回：2014-07-16）

Update of flow cytometry app lication in psoriasis research

LIU Han-qing，JIN Hong-tao，WANG Ai-ping.Institute ofMateria Medica，Chinese Academy ofMedical Sciences&Peking Union Medical College，100050

Flow cytometry（FCM）is a detection method which can quantitatively analyze separate single cells or other biological particles at the functional level.FCM can analyze thousands of cells rapidly and get multiple parameters from one cell.The progress of FCM application in psoriasis research is reviewed in this article.

psoriasis；flow cytometry；lymphocyte

國家重大新藥創(chuàng)制資助項目（編號：2013ZX09302302，

2012ZX09J12203，2012ZX09301002-001-009）

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京，100050

2北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，100176