麻風T細胞應答及TCR CDR3譜序研究進展

楊麗文 李月紅 姚新生

麻風T細胞應答及TCR CDR3譜序研究進展

楊麗文 李月紅 姚新生?

麻風的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機體免疫系統(tǒng)密切相關，其中T細胞介導的免疫應答發(fā)揮了關鍵性作用。T細胞通過T細胞受體(TCR)互補決定區(qū)CDR3與麻風分枝桿菌抗原結合，產(chǎn)生特異性T細胞免疫效應。測定TCR CDR3譜型分布特征能夠反映麻風分枝桿菌感染狀態(tài)下特定T細胞的擴增程度。本文就麻風T細胞應答及TCR CDR3譜序研究進展作一綜述。

麻風； T細胞應答； TCR； CDR3

麻風是由麻風分枝桿菌(M.leprae)感染引起的慢性傳染性疾病，它主要侵犯人體的皮膚、黏膜和外周神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷，嚴重者將導致殘疾。1盡管1982年聯(lián)合化療方案實施以來，麻風流行率已經(jīng)大幅下降，但據(jù)統(tǒng)計，2012年全球仍有232，857新病例發(fā)生，已經(jīng)嚴重影響了人類身體健康，因此麻風依舊是世界范圍內(nèi)一個嚴峻的公共衛(wèi)生問題。2目前研究已表明麻風與機體免疫系統(tǒng)不同程度的缺陷或功能異常密切相關，尤其是T細胞介導的細胞免疫。測定TCR CDR3譜型分布特征能夠反映麻風分枝桿菌感染狀態(tài)下特定T細胞克隆的擴增程度，因此對T細胞TCR CDR3譜系特點的進一步研究將有助于闡明麻風的免疫發(fā)病機制。本文就麻風有關T細胞應答及TCR CDR3譜系偏向研究進展作一綜述。

1 T細胞免疫應答與麻風

1.1 T細胞相關固有免疫應答 機體固有免疫系統(tǒng)承擔了抵抗M.leprae入侵的第一道防御，也在T細胞介導的免疫應答中起重要作用。M.leprae趨向寄生于皮膚的Mφ和外周神經(jīng)的施萬細胞內(nèi)。3Mφ在宿主抵抗M.leprae的感染過程中起重要作用，主要為抗原處理、提呈、分泌單核因子及殺滅胞內(nèi)病原體。通行Toll樣受體是Mφ表面識別不同病原菌的受體，可誘導產(chǎn)生各種免疫因子，發(fā)揮抗感染特性。4Krutzik等5研究表明，麻風免疫反應與Mφ上 Toll樣受體1/2 (TLR1/2)分布相關，且TLR1、TLR2在結核樣型麻風(TT)患者Mφ中明顯高表達。Soilleux等發(fā)現(xiàn)瘤型麻風(LL)患者Mφ高表達的DC－SIGN與Th2型免疫反應密切相關，可能抑制了Mφ活化、殺菌能力及其免疫反應。6此外LL病損中Mφ分泌的Th2型細胞因子或IL－10、前列腺素E2等因子可能在抗原提呈能力及細胞免疫反應下調(diào)中發(fā)揮一定的作用。7胞內(nèi)病原體(如分枝桿菌屬)通過抗原提呈細胞(APCs)上的抗原決定簇激活T細胞，但感染M.leprae的DCs表面的人類組織相容性抗原下調(diào)，產(chǎn)生IFN－γ，不能正常激活T細胞。8，9Kumar等10研究也發(fā)現(xiàn)，麻風中DCs的抗原提呈功能受損，改變了機體細胞因子及共刺激分子信號。另外，麻風感染病灶內(nèi)CD1b＋DCs是一種有效的抗原提呈細胞，能誘導麻風的T細胞免疫應答，該細胞的表達頻率與麻風的臨床類型相關，如TT中明顯高于LL。進一步研究發(fā)現(xiàn)CD1b＋DCs的分化與IL－32激活相關，IL－32衍生的DCs表達高水平的MHC I類及CD86分子，從而更有效地提呈抗原給CD8＋T細胞，發(fā)揮殺傷M.leprae作用。11

NK及NKT細胞在麻風固有免疫應答中也有重要作用。麻風易感人群中NK細胞活性低下，12II型麻風反應外周血中NK細胞數(shù)明顯降低，13多菌型麻風(MB)患者中的NK及T細胞產(chǎn)生的白介素類細胞

因子抑制了CTL活化及IFN－γ的分泌，且MB患者中Th2細胞分泌的IL－4，IL－13抑制了NK細胞成熟及其功能。14另外，麻風患者外周血中的NKT細胞數(shù)目明顯低于健康人群，下調(diào)了機體炎癥反應與免疫應答的能力。15

1.2 不同類型麻風的T細胞免疫應答 麻風多樣性的臨床表現(xiàn)與機體抵抗M.leprae發(fā)生的細胞免疫程度相關，細胞免疫較強時表現(xiàn)為TT，皮膚損害輕微，含菌量少；當其免疫功能低下時則表現(xiàn)為皮損量多，含菌量多的LL。在兩型之間還包括3種不穩(wěn)定的麻風類型:界線類偏結核樣型麻風(BT)、中間界線類麻風(BB)和界線類偏瘤型麻風(BL)。1，16英國學者Maw等研究發(fā)現(xiàn)，將含有T細胞亞群的淋巴制備液注入到感染麻風分枝桿菌的無胸腺BALB/c裸鼠的足墊中，可以增強小鼠對麻風分枝桿菌感染的抵抗力。17另外，麻風患者外周血中T細胞總數(shù)及T輔助細胞數(shù)目比正常人低，尤以瘤型麻風患者為著，然而發(fā)生逆向反應時與正常人相近。18這些早期研究表明麻風與T細胞介導的細胞免疫缺陷密切相關，但各型麻風與麻風反應中T細胞免疫應答各有不同。

LL是光譜免疫分類法中的一個極型，臨床表現(xiàn)為多發(fā)性、對稱性分布的皮損，累及外周神經(jīng)、眼睛、皮膚以及內(nèi)臟器官。LL病損中含有大量不同程度泡沫化改變的Mφ，只含少量的淋巴細胞，主要為CD8＋T細胞亞群，分泌IFN－β、IL－10、IL－4為主的Th2型細胞因子，能夠產(chǎn)生高滴度的抗體，但對機體無保護作用，亦不能形成抵抗麻風分枝桿菌生長繁殖的肉芽腫組織，因此該類患者預后較差，也是主要的傳染源。19另外研究已經(jīng)證實LL患者對麻風分枝桿菌抗原特異性T細胞無反應。2Saini等20研究發(fā)現(xiàn)Foxp3＋CD4＋CD25＋Tregs在LL患者抗原刺激的外周血單個核細胞(PBMC)中數(shù)目明顯高于BT患者，且LL中Foxp3、TGF－β、IL－10表達明顯高于TT/BT，暗示TGF－β可能對LL中T細胞免疫反應發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用。Bobosha等21分離LL患者PBMC中CD25＋Tregs細胞后發(fā)現(xiàn)有7/18(38.8%)患者獲得了對麻風分枝桿菌的免疫應答，而重新注入自體CD25＋Tregs后又表現(xiàn)為特異性T細胞無反應性，提示CD25＋Tregs與LL患者Th1無反應性免疫應答密切相關。此外，F(xiàn)oxp3＋CD8＋CD25＋Tregs也大量存在于LL患者的PBMC中，推測其對LL發(fā)病發(fā)揮一定的免疫抑制作用。

TT是光譜免疫分類法中的另一個極型，表現(xiàn)為少量、邊緣完整的皮損，只包含少量病菌。TT病損中心為發(fā)育良好的上皮樣巨噬細胞，周圍分布有大量淋巴細胞，主要是CD4＋T細胞亞群，分泌IFN－γ、IL－2為主的Th1型細胞因子，發(fā)揮強的Th1型細胞免疫應答，只能產(chǎn)生低滴度特異性抗體，但能夠形成抵抗麻風分枝桿菌生長繁殖的肉芽腫組織，預后較LL好，傳染能力不強，能自發(fā)痊愈。2在上述兩種極型麻風中間為臨床及免疫學上不穩(wěn)定的邊界型麻風，包括BT、BB、BL，其T細胞免疫應答能力與逐步增加的負荷量呈負向相關，這3類麻風患者不具有強的傳染性，但常并發(fā)麻風反應和嚴重的炎癥反應。2

1.3 麻風反應相關T細胞免疫應答 麻風反應是麻風治療過程中發(fā)生的遲發(fā)型超敏反應，以外周神經(jīng)發(fā)生急性劇烈炎癥反應為特點，常發(fā)生于聯(lián)合化療后的幾個月，分為I型與II型。I型反應又稱之為逆向反應(RR)，好發(fā)于BB、BL患者，其發(fā)生是機體針對M. leprae細胞免疫反應突然增強的結果，趨向轉(zhuǎn)化為TT，反映了以Th2型為主的免疫反應向Th1型為主的免疫反應轉(zhuǎn)變。17也有研究認為促炎性細胞因子TNF、IL－6、IL－1β及IP－10的上調(diào)及內(nèi)源性類固醇代謝的異常都參與了I型反應的發(fā)生。22II型反應主要發(fā)生于多菌型麻風(LL/BL)患者，CD4/CD8＋T細胞比率的失調(diào)及促炎性細胞因子IFN、IL－1β、TNF、IL－6及IL－12是導致反應出現(xiàn)的主要原因，20也有學者認為CD4細胞與TNF也參與了炎癥的發(fā)生。17

2 TCR CDR3與麻風

2.1 TCR CDR3結構特征 TCR是T細胞表面特異性識別抗原的受體，也是所有T細胞的特征性表面標志，人類T細胞膜上的TCR從結構上可分為TCRαβ與TCRγδ兩型，參與免疫應答的 T細胞主要為TCRαβ型。TCR結構中有三個互補決定區(qū):CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3區(qū)是直接識別特異性抗原的部位。TCRβ鏈CDR3區(qū)是由V－D－J－C基因片段重排及V、D，D、J之間隨機插入的核苷酸序列組成。由于包含多種基因、連接多樣性、組合的多樣性及插入核苷酸的隨機性，TCRβ鏈CDR3基因譜型具有高度的多樣性，特定的CDR3序列代表了特定的T細胞克隆，因此檢測特定CDR3序列的頻率可以推測特定T細胞的增殖狀況。23

2.2 TCR CDR3譜序與麻風 1992年Van Schooten等24用基因重排及PCR技術對來源于結核型麻風的20個T細胞克隆進行了分析，發(fā)現(xiàn)所有T細胞克隆都受HLA－DR2或HLA－DR3的限制，其中HLA－DR2限制性T細胞克隆中大部分取用Vβ18基因，少數(shù)取用Vβ5基因，但在HLA－DR3限制性T細胞克隆卻主要取用Vβ5基因。進一步分析發(fā)現(xiàn)此類T細胞克隆CDR3區(qū)的N－D－N區(qū)氨基酸組成都較相似，大多取用F－G－Q氨基酸基序。

Wang等25運用RT－PCR擴增方法分析了數(shù)名I型麻風反應患者皮損及外周血中TCR CDR3譜型分布特征，發(fā)現(xiàn)7例病人中Vβ基因家族的取用模式存在差異，而TCRVβ6、Vβ12、Vβ14及Vβ19基因在絕

大多數(shù)皮損中都存在高表達現(xiàn)象，且頻率顯著高于其外周血中的表達。此外，還發(fā)現(xiàn)相同病人不同皮損間Vβ基因家族的取用相對一致，逆向反應發(fā)生前與反應期間TCRVβ基因的取用存在動態(tài)變化，反應期間取用特定Vβ基因的T細胞家族大幅增加。研究者對與麻風反應始終密切相關的TCR Vβ6＋T細胞克隆進行深入分析，發(fā)現(xiàn)Vβ6.1與Jβ2.7基因被頻繁取用，CDR3區(qū)存在重復的核苷酸序列，第2位的半胱氨酸與第8位的甘氨酸具有保守性，推測可能為特異性抗原的識別位點。

隨后Wang等26又同時測定了不同類型麻風患者的皮膚組織、PBMC中TCR Vβ庫，結果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)結核型麻風皮損中TCR基因亞群Vβ6.1～6.4明顯高表達，Vβ6.5、6.8及6.9優(yōu)勢表達，但其在瘤型麻風皮損中相對低表達。此外，Vβ6.6、6.7在兩種類型麻風中都存在相對過表達現(xiàn)象。為了進一步探究Vβ6 TCR CDR3譜型特點，對Vβ6.1－4－CβPCR產(chǎn)物進行核苷酸及氨基酸序列分析，核苷酸水平發(fā)現(xiàn)1例患者皮損CDR3區(qū)有兩條β鏈存在重復序列，另1例患者皮損中未發(fā)現(xiàn)重復序列，同時這2例患者的PBMC中均未發(fā)現(xiàn)重復序列，然而對Jβ基因片段取用分析時發(fā)現(xiàn)Jβ2.2在麻風患者皮損及PBMC中都存在高表達，顯示Vβ6 TCR取用了特定的Jβ基因片段，上述表明同一病例及不同病例之間CDR3區(qū)呈現(xiàn)多樣性；氨基酸序列分析顯示Vβ6.1－4 CDR3區(qū)存在保守的氨基酸基序:L－X－G，L－T－S－G，L－X－G－X－G，提示TCR Vβ6＋T細胞能夠識別特異性麻風分枝桿菌抗原。

Sabet等27也發(fā)現(xiàn)TCR BV6＋T細胞在結核型麻風與I型麻風反應皮損中明顯高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)來源于結核型麻風病人的BV6＋T細胞克隆TCR序列與BV6＋T細胞TCR序列相似，兩者的BV鏈都特定取用相同的BV6S3A1N1T基因，此外還發(fā)現(xiàn)該類T細胞克隆CDR3區(qū)編碼了一個保守的氨基酸基序LS－G，這與Wang早期的研究結果基本相符，提示其識別特異性抗原的可能?？贵w封閉實驗、表型分析與免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BV6＋T細胞的表達受MHC II類分子的限制，為HLA－DR15，51a限制性的CD4＋T細胞克隆，分泌IFN－γ類Th1型細胞因子、穿孔素、抗菌蛋白粒溶素，并能夠通過胞吐顆粒蛋白酶的方式直接溶解麻風分枝桿菌抗原提呈細胞，但其不能產(chǎn)生IL－4類Th2型細胞因子，因此BV6＋T細胞克隆被認為是Th1型T細胞克隆。此外，結核樣型麻風及I型麻風反應型皮損中NK T細胞TCR Vα也存在偏向取用，28其中TCRVα6、Vα14、Vα24基因明顯高表達，Vα6與Jα4、5，Vα14與Jα30、31、32、33、34、48、49存在優(yōu)先配對現(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)在不同TT患者皮損中TCR Vα6－Jα5＋CDR3區(qū)氨基酸基序高度相似，提示該T細胞克隆可能識別麻風分枝桿菌表面特異性抗原。這些研究表明αβTCR CDR3譜型與麻風的發(fā)生發(fā)展密切相關。

3 展望

綜上所述，麻風免疫發(fā)病機制極其復雜，機體在抵抗麻風分枝桿菌的免疫反應中，T細胞免疫起重要作用，尤其是T細胞數(shù)量及功能缺陷與麻風的進程密切相關。另外，T細胞TCR CDR3譜系偏向性與麻風的進程顯著相關，但其詳細機制尚未完全清晰。最新研究發(fā)現(xiàn)，對 TCRVβ14，Vβ23基因表達及 TCR Vβ5.1，Vβ20區(qū)的CDR3特征性氨基酸結構序列的測定，可以用來臨床診斷和治療各種活動性結核及潛伏性結核感染。29與此同時，結核分枝桿菌和M.leprae感染機體的免疫機制頗似。因此，對TCR CDR3譜序的進一步深入研究，將極有可能為臨床研制預防性疫苗、早期診斷及治療麻風提供新異的方法和思路。

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(收稿:2014－10－25)

T cell response and TCR CDR3 spectratyping in patients w ith leprosy

YANG Li-wen，LIYue-hong，YAO Xin-sheng.Department of Immunology，ZunyiMedical College，Immunology Innovation Base ofPostgraduate Education in Guizhou Province，Zunyi，563003

Immune system，especially T cell response，plays an important role in the occurrence，development，and transformation of leprosy.The specific binding of M.leprae antigen and complementarity determining region 3(CDR3)of T cell receptor(TCR)induce the specific T cell response.The feature of TCR CDR3 can reflect the clone degree of specific T cells after infected by M.leprae.The update of T cell response and TCR CDR3 spectratyping in the patients with leprosy were reviewed in this paper.

leprosy；T cell response；TCR；CDR3

國家自然科學基金(編號:31160195)國家重點基礎研究發(fā)展 973計劃前期專項(編號: 2008CB517300)

遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州省免疫學教育創(chuàng)新基地，貴州遵義，563003?通信作者