ASPP1在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的表達(dá)下調(diào)與超甲基化、凋亡活動(dòng)及葡萄胎預(yù)后相關(guān)性的研究

郝志敏，朱虹

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江 寧波315000）

·臨床研究·

ASPP1在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的表達(dá)下調(diào)與超甲基化、凋亡活動(dòng)及葡萄胎預(yù)后相關(guān)性的研究

郝志敏，朱虹

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江 寧波315000）

目的探討ASPP1在不同滋養(yǎng)細(xì)胞組織中促甲基化作用和表達(dá)水平，以及在體外絨毛膜癌JEG-3和JAR細(xì)胞株的效應(yīng)，判定其與葡萄胎惡變的相關(guān)性。方法 通過(guò)定量PCR和免疫組化技術(shù)，檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞中ASPP1 mRNA表達(dá)水平。用MS-PCR技術(shù)評(píng)估ASPP1 mRNA表達(dá)與甲基化狀態(tài)相關(guān)性，及ASPP1在正常胎盤和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中表達(dá)差異。用TUNEL法檢測(cè)ASPP1表達(dá)與增殖指數(shù)（Ki67，MCM7）、凋亡指數(shù)（M30細(xì)胞凋亡抗體）、P53、caspase-8相關(guān)性。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示ASPP1在絨毛膜癌和葡萄胎中表達(dá)低于正常胎盤組織中的表達(dá)(P＜0.01），進(jìn)展為持續(xù)性葡萄胎組低于自然消退組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。ASPP1表達(dá)與增殖指數(shù)（Ki67，MCM7）、凋亡指數(shù)(M30）、P53、caspase-8高度相關(guān)。ASPP1通過(guò)內(nèi)源性與外源性路徑誘導(dǎo)凋亡，上調(diào)活化的caspase-9及配體蛋白的表達(dá)。結(jié)論ASPP1通過(guò)超甲基化的表達(dá)下調(diào)進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡可能在葡萄胎的發(fā)病機(jī)制及葡萄胎惡變中發(fā)揮作用。

凋亡；ASPP1；絨毛膜癌；妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病；超甲基化；甲基化

葡萄胎是一種良性疾病，多數(shù)葡萄胎在吸宮后病灶自然消退，然而仍有10%～20%葡萄胎會(huì)進(jìn)展成持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤而需要化療[1]。對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)制已進(jìn)行過(guò)大量的遺傳學(xué)和生物學(xué)研究，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，既往研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡下降可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。P53凋亡刺激蛋白1（ASPP1）能夠與P53蛋白結(jié)合增強(qiáng)該蛋白的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2]；近來(lái)研究表明ASPP1在野生型P53陽(yáng)性的人類癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，如乳腺癌[3]，小細(xì)胞肺癌[4]及急性粒細(xì)胞白血病[5]，但關(guān)于ASPP1在滋養(yǎng)細(xì)胞中的作用機(jī)制研究甚少。本研究中，為了揭示ASPP1在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病發(fā)病機(jī)制及臨床預(yù)后中的作用，本文檢測(cè)ASPP1在正常胎盤組織及滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)以及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性，同時(shí)進(jìn)行了體外細(xì)胞功能分析。

1 材料與方法

1.1材料 檢測(cè)87例滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本，包括19例早期正常絨毛組織，13例足月胎盤，50例完全性葡萄胎（妊娠5～28周，平均14周），5例絨毛膜癌，在完全性葡萄胎組中42例良性轉(zhuǎn)歸，8例發(fā)生惡變。葡萄胎及絨毛膜癌標(biāo)本來(lái)自于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2009～2012年病理存檔的石蠟切塊。采用定時(shí)PCR和MS-PCR技術(shù)，提取50例葡萄胎，5例絨毛膜癌，13例足月胎盤和19例早期正常絨毛組織的cDNA及DNA。早期絨毛組織為人工流產(chǎn)的新鮮組織，足月胎盤為正常分娩后的胎盤組織，葡萄胎或絨毛膜癌組織為吸宮術(shù)或子宮切除術(shù)的標(biāo)本。所有組織均獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并符合組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。葡萄胎后發(fā)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷凡符合下列標(biāo)準(zhǔn)中的任何一項(xiàng)且排除妊娠可能即可診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（GTN）：（1）葡萄胎排空后HCG測(cè)定連續(xù)4次呈平臺(tái)狀態(tài)

（±10%），并持續(xù)3周或更長(zhǎng)時(shí)間 ，即1、7、14、21日； （2）葡萄胎排空后HCG測(cè)定連續(xù)3次 升高（＞10%），并至少持續(xù)2周或更長(zhǎng)時(shí)間，即1、7、14日；（3）葡萄胎排空后HCG水平持續(xù)異常達(dá)6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間；（4）組織學(xué)診斷。

1.2方法 葡萄胎組織經(jīng)過(guò)顯微鏡切割及染色體原位雜交后進(jìn)行熒光微衛(wèi)星基因定位。從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索增殖與凋亡指數(shù)與ASPP1免疫反應(yīng)的相關(guān)性。

1.2.1免疫組化試驗(yàn)4μm石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；置入檸檬酸緩沖液 （pH= 7.6），在高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，加熱至沸騰l分鐘，室溫下冷卻15分鐘；每張切片滴加30μL內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑（試劑A），以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，ASPP1（LXO54.2）（Sigma、St Louis、MO、USA）鼠抗人單克隆抗體1：200稀釋、孵化，新鮮配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡觀察、攝片。免疫組化用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知的正常早期絨毛組織作為陽(yáng)性對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性染色為細(xì)胞漿著色，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率來(lái)判定結(jié)果:無(wú)細(xì)胞顯色為（-）；0%～25%細(xì)胞顯色為（+）；25%～50%細(xì)胞顯色為 （++）；50.1%～75.0%細(xì)胞顯色為（+++）；75.1%～100%細(xì)胞顯色為 （++++）。ASPP1蛋白陽(yáng)性定位以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顯色為ASPP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)5個(gè)高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。免疫組化結(jié)果采用半定量計(jì)分法判定，根據(jù)Remmele和stegner提出的免疫反應(yīng)積分（IRS）打分，它采用染色強(qiáng)度（SI）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比（PP）的乘積，即IRS=SI×PP，分級(jí)如下，IRS：0～3分為陰性（－），4～6分為弱陽(yáng)性 （+），8～9分為中度陽(yáng)性（++），12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.2.2定時(shí)定量PCR根據(jù)已知的研究程序?qū)嵤┒縋CR。Trizol試劑 （Invitrogen，Life Technologies Inc.，Rockville，MD，USA）提取2.5μgRNA，用寡核苷酸作為引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)合成DNA，在ABI PRISM 7900序列檢測(cè)體系（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）實(shí)施定量PCR。使用的引物詳見(jiàn)表1，磷酸甘油醛脫氫酶DNA擴(kuò)增作為對(duì)照組。以磷酸甘油醛脫氫酶表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)，用2DDCT方法確定ASPP1表達(dá)。

1.2.35-脫氧胞苷和曲古柳菌素處理絨毛膜癌細(xì)胞 人絨毛膜癌JEG-3及JAR細(xì)胞系引自北京中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。絨毛膜癌細(xì)胞株在10%胎牛血清及100U/mL青霉素及鏈霉素組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。處理JEG-3和JAR細(xì)胞，5 mM 5’-aza-2’脫氧胞苷

（5-aza-dc，Sigma）培養(yǎng)3天，0.3 mM曲古柳菌素（TSA，Sigma）培養(yǎng)1天，然后兩者結(jié)合（5 mM 5-aza-dc兩天，然后5 mM 5-aza-dc和0.3 mM TSA 1天）。以中介物二甲基亞砜作為對(duì)照組，在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)收集細(xì)胞。

1.2.4DNA配置、亞硫酸鈉修復(fù)和MS-PCR在未甲基化的胞核嘧啶經(jīng)過(guò)蛋白激酶K的消化并利于硫酸氫鈉處理時(shí)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，然后用苯酚氯仿提取5μgDNA，用QIAEX II kit（Qiagen，Hiden，Germany）提純DNA，根據(jù)已知的MS-PCR分析的研究，甲基化和未甲基化敏感的引物，如表1所示，被設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增ASPP1啟動(dòng)基因 （-681 to-476）（GeneBank NM 015316）。甲基化DNA（Chemicon，Atlanta，GA，USA）作為PCR陽(yáng)性對(duì)照，沒(méi)有模板的空白鏈作為陰性對(duì)照。在95℃烤箱中放置10分鐘使蛋白變性，然后95℃、59℃、72℃各30秒。PCR完成了35個(gè)周期，30秒在95℃，30秒在55℃。在2%的瓊脂凝膠電泳中分離MS-PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色，紫外線照射成像。

1.2.5ASPP1轉(zhuǎn)染、蛋白印記分析，亞細(xì)胞定位用脂質(zhì)體法2000將ASPP1合成物轉(zhuǎn)染到JEG-3和JAR培養(yǎng)基。反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（PCDNA）定量3.1作為對(duì)照組，用含有蛋白抑制劑的SDS緩沖液提取總蛋白溶解液。用親和性洗滌劑 （Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）蛋白實(shí)驗(yàn)確定蛋白含量。通過(guò)SDS-PAGE溶解20μg蛋白轉(zhuǎn)染到氯乙烯細(xì)胞膜，再針刺到相對(duì)應(yīng)的抗體中。蛋白印記使用的抗體詳見(jiàn)表2。用ProteoExtract Native細(xì)胞膜蛋白提取基 （Calbiochem，San Diego，CA，USA）分離JEG-3細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

1.2.6轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記 用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)基（Roche Biochemical，Indianapolis，IN，USA）實(shí)施轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記（TUNEL）。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為對(duì)照組，用ASPP1轉(zhuǎn)染后的JEG-3和JAR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在光學(xué)顯微鏡下呈40倍放大，觀察3個(gè)視野。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。χ2檢驗(yàn)檢測(cè)各組的甲基化計(jì)數(shù)資料；兩樣本間的計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析ASPP1和增殖指數(shù)及凋亡指數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1ASPP1在絨毛膜癌和葡萄胎中表達(dá)下調(diào)，而且與葡萄胎的進(jìn)展有關(guān) 研究結(jié)果顯示，ASPP1免疫組化染色主要定位于絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在合體滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間質(zhì)、蛻膜染色較淺且局限（第76頁(yè)圖1A-1E），和早孕絨毛組織相比，絨毛膜癌和葡萄胎的ASPP1免疫表達(dá)下調(diào)（圖1）。在絨毛膜癌的合體滋養(yǎng)細(xì)胞

ASPP1免疫表達(dá)范圍局限，強(qiáng)度弱 （第76頁(yè)圖1E），更重要的是，在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的ASPP1表達(dá)在葡萄胎惡變組顯著低于良性轉(zhuǎn)歸組（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。ASPP1抗體在JEG-3的亞細(xì)胞片段的蛋白印記分析顯示在細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)表達(dá)175 kDa，而在細(xì)胞核無(wú)表達(dá)（圖2）。研究結(jié)果與ASPP1在免疫組化中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)一致。

2.2ASPP1啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)相關(guān)性 在cDNA樣本檢測(cè)的定量PCR結(jié)果表明：mRNA在正常早期絨毛組織的表達(dá)高于葡萄胎（P=0.003）及絨毛膜癌（P=0.001）（圖3）。ASPP1 mRNA在絨毛膜癌中的表達(dá)低于葡萄胎。ASPP1在足月胎盤中的表達(dá)水平高于其在早期絨毛組織中的表達(dá)（P=0.004）。體外研究表明，JEG-3經(jīng)過(guò)5-氮-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine）處理后ASPP1表達(dá)上升2倍，經(jīng)過(guò)曲古柳霉素A（TSA）處理后ASPP1表達(dá)上升5倍，而在JAR中分別上升2倍和7倍。兩種藥物雙重處理JEG-3及JAR后ASPP1 mRNA表達(dá)分別上升10倍和5倍 （圖4）。結(jié)果表明，DNA甲基化可能與ASPP1失活在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中發(fā)揮重要作用有關(guān)。甲基化PCR研究表明，葡萄胎中DNA甲基化等位基因頻率高于正常胎盤組織 （圖5）。甲基化ASPP1等位基因表達(dá)在葡萄胎中為34.8%（16/ 46）在正常早期絨毛中為11.8%（2/17），足月胎盤中為22.2%（2/9）。此外，ASPP1 mRNA表達(dá)與甲基化狀態(tài)高度相關(guān)（r=0.702，P=0.029）。絨毛膜癌同時(shí)含有甲基化及未甲基化狀態(tài)的ASPP1的等位基因（圖5）。

2.3ASPP1在JEG-3和JAR中過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)凋亡和上調(diào)配體表達(dá) 為了探索ASPP1在凋亡中的作用，在JEG-3和JAR細(xì)胞中實(shí)施了ASPP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。蛋白印跡轉(zhuǎn)染48小時(shí)后評(píng)估轉(zhuǎn)染效應(yīng)。如TUNEL實(shí)驗(yàn)所述，JEG-3和JAR空白載體凋亡細(xì)胞數(shù)百分比分別為2.4%和3.5%，然而ASPP1過(guò)度表達(dá)可以使凋亡細(xì)胞數(shù)分別升高到9.4%和13.3%，詳見(jiàn)第76頁(yè)圖2A-2B和第77頁(yè)圖1。

數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索葡萄胎中增殖指數(shù) （Ki67和MCM7）、M30凋亡指數(shù)、P53的表達(dá)與ASPP1表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果表明ASPP1與P53呈負(fù)相關(guān) （r=-0.482；P＜0.001）Ki67（r=-0.304；P=0.020）MCM7增殖指數(shù) （r=-0.409；P=0.016），M30表達(dá)的凋亡指數(shù)（r=-0.397；P=0.004）。此外，ASPP1表達(dá)與caspase-8的免疫表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.458；P=0.024），而ASPP1轉(zhuǎn)染的絨毛膜癌細(xì)胞caspase-9表達(dá)升高，說(shuō)明ASPP1可以通過(guò)內(nèi)源性凋亡路徑刺激凋亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)ASPP1免疫計(jì)數(shù)與caspase-8呈正相關(guān)，故caspase-8在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病凋亡外源性路徑中表達(dá)下調(diào)。ASPP1異位表達(dá)定量PCR研究發(fā)現(xiàn)配體mRNA表達(dá)增加，但是受體和TRAF2表達(dá)不變,還發(fā)現(xiàn)配體受體mRNA表達(dá)中等強(qiáng)度增加。后來(lái)的蛋白印跡分析結(jié)果表明在ASPP1過(guò)度表達(dá)后出現(xiàn)配體蛋白表達(dá)上調(diào)（圖6-7），其中FasL和Fas表達(dá)明顯上調(diào)。在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中ASPP1及caspase-8表達(dá)均下調(diào)，說(shuō)明ASPP1可能通過(guò)Fas/FasL體系控制凋亡的外源性路徑。

3 討論

滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于受精卵的著床、胎盤形成及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮至關(guān)重要的作用，在滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移時(shí)的分子機(jī)制或信號(hào)傳導(dǎo)路徑發(fā)生改變可能導(dǎo)致葡萄胎的發(fā)生及惡變[6]。既往研究表明凋亡在滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)理中尤為重要[7-9],而對(duì)P53相關(guān)基因及調(diào)控基因的研究有助于了解滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)制，ASPP1能夠與P53蛋白結(jié)合繼而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛膜癌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化和微量蛋白印記分析，結(jié)果表明ASPP1免疫反應(yīng)主要定位于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，和ASPP1首次報(bào)道結(jié)果相一致[10-11]。本研究中，用ASPP1抗體LOX54.2判定ASPP1N端（1-308），具有完整N端調(diào)控區(qū)的長(zhǎng)鏈ASPP1將其免疫反應(yīng)最大化，對(duì)P53的轉(zhuǎn)活刺激強(qiáng)度強(qiáng)于缺少N端調(diào)控區(qū)的ASPP1轉(zhuǎn)染。因此，抗ASPP1抗體LOX54.2可以辨認(rèn)內(nèi)在的完整的ASPP1，其可以顯示P53完整的調(diào)控功能。雖然ASPP1表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，P53表達(dá)定位于細(xì)胞核，但是既往研究表明，ASPP1含有靶序列將其導(dǎo)向細(xì)胞質(zhì)，ASPP核心轉(zhuǎn)染區(qū)（872-1090）和綠色熒光蛋白溶合蛋白導(dǎo)致合成物定位于細(xì)胞核[12]，然而全長(zhǎng)的ASPP1（1-1090）-GFP融合蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，后者符合本文的免疫組化結(jié)果，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后的基因修復(fù)和結(jié)合蛋白有助于ASPP1在不同亞細(xì)胞分割間的

交換，然后充分發(fā)揮其生物作用。ASPP1在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中表達(dá)定位于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，有學(xué)者認(rèn)為正是這兩種細(xì)胞的干細(xì)胞的特性決定了滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生[13]。

本次免疫組化研究還發(fā)現(xiàn)，ASPP1表達(dá)在足月胎盤及正常早孕絨毛組織中最高，在葡萄胎良性轉(zhuǎn)歸組及惡變?yōu)樽甜B(yǎng)細(xì)胞腫瘤組的表達(dá)依次降低，在絨毛膜癌細(xì)胞株中表達(dá)最低，說(shuō)明ASPP1低表達(dá)預(yù)測(cè)葡萄胎有一定的惡變潛能，與Mak等[14]的研究結(jié)果相一致，認(rèn)為ASPP1通過(guò)內(nèi)源性與外源性路徑誘導(dǎo)凋亡，上調(diào)活化的半胱天冬酶9及配體蛋白的表達(dá)，故推測(cè)ASPP1的凋亡表達(dá)逐漸丟失可能阻礙了細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的日益凋亡，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生。

定量PCR結(jié)果表明ASPP1 mRNA在正常早期絨毛組織的表達(dá)高于其在葡萄胎及絨毛膜癌組織中的表達(dá)，在絨毛膜癌中的表達(dá)低于葡萄胎，在足月胎盤中的表達(dá)水平高于其在早期絨毛組織中的表達(dá)，再次證明了滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡下降導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生。用5-aza-dc處理mRNA后的表達(dá)，結(jié)果表明，在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的進(jìn)展中，反向DNA甲基化有助于ASPP1表達(dá)下調(diào)。腫瘤抑制基因的DNA超甲基化和干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)已有報(bào)道[15]。此外，用組蛋白去

乙?；敢种苿㏕SA和去甲基化5-氮脫氧胞苷處理細(xì)胞，可以協(xié)同激活A(yù)SPP1 mRNA的表達(dá)，在SOX2的研究中已報(bào)道過(guò)[16]?；蛉ゼ谆徒M蛋白去乙?；甘潜夭豢缮俚模沁€包括外源性調(diào)節(jié)機(jī)制。甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白能夠啟動(dòng)HDAC和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，然而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能夠直接結(jié)合HDAC，表明了DNA甲基化和組蛋白去乙?；嗷プ饔?。有趣的是，TSA誘導(dǎo)ASPP1 mRNA表達(dá)活力高于5-氮脫氧胞。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TSA通過(guò)組蛋白去乙?；饔迷诩谆[瘤抑制基因中能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化，TSA對(duì)組蛋白去乙?；虳NA去甲基化的選擇性交叉反應(yīng)能夠影響ASPP1表達(dá)[17]。

通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASPP1和P53、增殖指數(shù)（Ki67 and MCM7）、凋亡指數(shù)（M30）的相關(guān)性分析時(shí)呈負(fù)相關(guān)，表明ASPP1可能在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中平衡增殖與凋亡，具有重要意義。

ASPP1與P53結(jié)合，通過(guò)內(nèi)源性路徑激活凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，如BAX、PUMA。研究結(jié)果表明，表達(dá)野生型P53的絨毛膜癌細(xì)胞中ASPP1的表達(dá)可以誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)活化的caspase-9表達(dá)增加，證明ASPP1激活凋亡的內(nèi)源性路徑，作者還發(fā)現(xiàn)ASPP1和caspase-8的全部形式具有相關(guān)性。在以前的凋亡實(shí)驗(yàn)中已報(bào)道，caspase-8是凋亡外源性路徑的一個(gè)成員，其表達(dá)在絨毛膜癌組與正常胎盤組織相比顯著下調(diào)[18]。作者研究證明了在絨毛膜癌細(xì)胞中配體和受體共同表達(dá)以及在ASPP1轉(zhuǎn)染后配體表達(dá)上調(diào)，是ASPP1誘導(dǎo)凋亡的外源性路徑。組織的生理性細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，配體和受體的共同表達(dá)與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)[19]，滋養(yǎng)細(xì)胞中配體和受體通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制相互作用[20]?？傊?，研究結(jié)果揭示了ASPP1和Fas/FasL體系可能相互作用，特別是在有活力的滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡的外源性路徑。

綜上所述，本文探索了滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中ASPP1通過(guò)超甲基化誘導(dǎo)凋亡的表達(dá)下調(diào)與葡萄胎的進(jìn)展及惡變相關(guān)，還揭示了滋養(yǎng)細(xì)胞中凋亡的外源性路徑中ASPP1和Fas/FasL相互作用，提示ASPP1可能通過(guò)凋亡效應(yīng)在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病發(fā)病機(jī)制及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

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