WHO 2014年版《耐藥結核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》解讀之五(耐藥結核病實驗室檢測)

王偉 劉京銘 李傳友

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WHO 2014年版《耐藥結核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》解讀之五(耐藥結核病實驗室檢測)

王偉 劉京銘 李傳友

結核病實驗室檢測是確診結核病，尤其是耐藥結核病的重要依據(jù)，標準化操作是保證實驗室質(zhì)量的重要前提。耐藥結核病的確診需要檢測到結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)并且進行藥物敏感性試驗(drug susceptibility testing，DST)，通過培養(yǎng)分離細菌菌株鑒定種屬，采用液體或固體培養(yǎng)進行DST，或采用WHO認可的分子檢測Mtb DNA和耐藥突變來實現(xiàn)[1]。早期耐藥檢測對治療方案的制定和控制結核病流行非常重要。由于傳統(tǒng)耐藥結核病診斷周期過長，延誤有效的治療方案制定，增加了耐藥結核病傳播概率，甚至在診斷期間患者體內(nèi)出現(xiàn)新的耐藥菌株，易導致根據(jù)DST 結果制定的治療方案失敗。因此，僅準確診斷仍然不能有效服務于耐藥結核病控制，只有早期且準確地進行耐藥結核病實驗室診斷才是解決問題的關鍵。

WHO 2014 年版《耐藥結核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》(簡稱“《手冊》”)[2]中突出了耐藥結核病實驗室早期準確診斷的重要性，并用專門有獨立的章節(jié)對這部分內(nèi)容進行了闡述，從基本概念、實驗室設置、實驗室網(wǎng)絡的組織、臨床樣本轉(zhuǎn)運、實驗室檢測技術、DST 的合理使用、檢測報告時間與周期、實驗室生物安全和質(zhì)量控制等方面做了全面而詳細的論述?？紤]到任何指南的實施均需與應用指南的國家或地區(qū)的實際情況相結合，指南中并非所有內(nèi)容均適合各地實際情況，因此筆者對耐藥結核病相關概念和實驗室技術等部分進行了重點介紹和解讀，對其他部分僅進行簡要的介紹；希望對手冊中的本部分內(nèi)容的解讀是一個有機整體又重點突出。

基本概念

《手冊》[2]在實驗室工作的這一章節(jié)與《耐藥結核病規(guī)劃管理指南(2008緊急更新版)》[3]相比，對實驗室檢測及DST的基本定義進行了部分更新和重新闡述，剔除了最低抑菌濃度的概念，增加了表型DST(phenotypic DST)、基因型DST(genotypic DST, 即分子藥敏試驗，molecular DST)、直接檢測(direct testing)和間接檢測(indirect testing)及有效性(validity)等概念[1]。與文獻[3]基本保持了一致的概念包括臨界藥物濃度(critical drug concentration)重復性(reproduci-bility)，可靠性(reliability)和交叉耐藥(cross resistance)。

一、重復性

指在獨立的條件下試驗或檢測能被精確地重復或復制的能力。重復性與不同實驗室、不同技術員或?qū)＜抑貜瓦M行該試驗的結果一致性相關。

二、可靠性

在相同條件下重復試驗時，其結果一致性的程度?？煽啃圆⒉灰馕吨_性。一個可靠的試驗可產(chǎn)生一致性的結果但不一定是正確的。例如，即使一個試驗有很好的可靠性，但未必能給予臨床正確的指導。

三、交叉耐藥

對某一種抗結核藥物產(chǎn)生耐藥突變，可能也對該類藥物中其他或全部的藥物產(chǎn)生耐藥。對不同種類藥物的耐藥則少見。

四、臨界藥物濃度

這一概念有了較之前更具體的闡述，可抑制95%的分離自患者且從未經(jīng)治療或暴露于該藥物的結核分枝桿菌(假設為敏感菌株)，但此藥物濃度不能抑制分離自該藥物治療無效患者的菌株(假設為耐藥株)。類似乙胺丁醇的藥物，沒有合適的藥物濃度符合該定義。對于此類藥物，用于表型DST的臨界藥物濃度，不能很好地區(qū)分敏感株與耐藥株。

五、表型DST

在某種抗結核藥物存在的情況下，能否檢測到分離株的生長或代謝的活性。

六、基因型DST

基因型檢測結核分枝桿菌基因組中與特定耐藥相關的突變；與此同時基因型檢測還可通過檢測結核分枝桿菌特定序列的存在情況以用于菌種鑒定。

七、直接檢測

直接對臨床樣本(通常指痰標本)進行檢測，將加工處理過的臨床樣本直接接種到含藥或無藥的培養(yǎng)基上，或者經(jīng)處理后直接用于分子檢測。

八、間接檢測

基于對培養(yǎng)后的結核分枝桿菌進行檢測[4]。

九、有效性

某項檢測的有效性是指是否檢測了應當檢測的內(nèi)容。理想情況下，DST檢測結果應當可以預測臨床療效。

實驗室檢測技術

《手冊》[2]在這部分依次介紹了涂片鏡檢、Xpert Mtb/RIF和線性探針檢測(line probe assays, LPAs)兩項分子檢測技術，以及培養(yǎng)及菌種鑒定、DST等實驗室檢測方法。涂片鏡檢技術提到了引入發(fā)光二極管(LED)熒光顯微鏡技術后，較傳統(tǒng)涂片鏡檢敏感度更高，還可大大節(jié)約檢測時間。分子檢測技術Xpert Mtb/RIF和LPAs技術是對文獻[3]內(nèi)容的更新和修訂。此外，《手冊》[2]在這一部分對DST的局限性和交叉耐藥問題也做出了一定的解釋和說明。

一、涂片鏡檢

《手冊》[2]指出，WHO推薦引入LED熒光顯微鏡技術，該項技術的引入可以在不增加總測試成本的基礎上提高檢測敏感度，同時也大大節(jié)省了檢測時間。涂片抗酸染色鏡檢無法區(qū)分活菌與死菌，也無法區(qū)分敏感與耐藥，更無法鑒定種屬，對耐藥結核病療效進行監(jiān)測的價值有限。耐藥結核病涂片鏡檢的目的主要限于評估初始細菌載量。當抗酸染色鏡檢陽性而培養(yǎng)陰性時，說明細菌可能為死菌，但并不能排除這類患者的傳染性。當抗酸染色鏡檢呈陽性，分子檢測結果陰性則應考慮可能是非結核分枝桿菌(NTM)感染。當前我國分子診斷產(chǎn)品多樣，如PCR-熒光探針、多重PCR等技術均可較好地區(qū)分結核分枝桿菌與NTM，條件允許的情況下可適當應用上述技術，以避免誤診[5-6]。

二、Xpert Mtb/RIF

WHO在《手冊》[2]中提出，患者有耐藥結核病風險時，建議優(yōu)先使用Xpert Mtb/RIF?作為初始診斷工具，而非涂片鏡檢、培養(yǎng)和表型DST。該技術在2010年得到了WHO的認可，目前是全球范圍內(nèi)被大力推廣的結核病包括耐藥結核病診斷技術之一。該技術的主要優(yōu)越性在于其敏感度、特異度及準確度與固體培養(yǎng)相似，但其耗時非常短，可在2 h內(nèi)完成測試并報告結果，可同時對結核分枝桿菌復合群進行DNA鑒定及利福平耐藥相關基因突變的檢測。因此，WHO推薦該技術作為MDR-TB高危人群的初選診斷方法。2013年底頒布了政策更新，指出該試劑盒應優(yōu)先于傳統(tǒng)涂片鏡檢、培養(yǎng)和DST作為成人和兒童疑似MDR-TB或HIV共感染TB的初選診斷方法。該技術可作為成人及兒童MDR-TB和HIV低風險人群鏡檢后的補充檢測手段，尤其當痰涂片結果為陰性時。該技術可替代傳統(tǒng)鏡檢和培養(yǎng)作為初選診斷方法應用于所有疑似結核的成年患者[7-8]。

三、LPAs技術

這項技術于2008年得到WHO的推薦，用于快速檢測單獨利福平或利福平合并異煙肼耐藥。LPAs技術有高通量的特點，每天可以完成幾個批次的檢測?！妒謨浴穂2]提到，LPAs適用于中央或者國家參比實驗室，地區(qū)級實驗室要確保有適當基礎設施(需要3個獨立的房間)的條件下，也可以承擔該項檢測。該技術在實際應用中也存在一定的局限性，如檢測結果需人工判讀，有可能導致不同實驗室之間，甚至同一實驗室不同操作人員的報告結果不一致，操作流程較復雜，很難標準化；其次，該技術僅限于檢測已知的結核分枝桿菌耐藥突變位點；另外，目前可用的LPAs只適用于抗酸染色陽性的痰樣本或者常規(guī)培養(yǎng)得到的結核分枝桿菌分離株。

四、結核分枝桿菌培養(yǎng)

較文獻[3]不同的是，WHO在《手冊》[2]中明確指出液體培養(yǎng)基是當前結核病細菌學確診的參考方法。同時提出，高質(zhì)量的標本、及時的運輸，以及有質(zhì)量保證的實驗室對于提高培養(yǎng)檢出率十分必要。兩個版本都強調(diào)了人為操作原因?qū)е洛e誤的檢查結果，諸如貼錯標簽或氣溶膠產(chǎn)生過程中導致標本之間的交叉污染等，均可導致假陰性或者假陽性結果。因此，實驗室報告的結果應結合患者臨床情況，必要時要重復進行相關檢測。

液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)結核分枝桿菌的復蘇率高且耗時短，液體培養(yǎng)是一個更加靈敏的培養(yǎng)系統(tǒng)，其污染率較固體培養(yǎng)方法高。與固體培養(yǎng)相比，NTM分離株在液體培養(yǎng)基出現(xiàn)頻率更高，因此，進行菌種鑒定加以區(qū)分是十分必要的。

五、結核分枝桿菌菌種鑒定

在結核病高負擔國家，大多數(shù)分枝桿菌分離株均為結核分枝桿菌?！妒謨浴穂2]指出，在不同的國家和地區(qū)，NTM的流行程度不同，某些地區(qū)可能高于HIV感染人群。因此，必須對所有分離自液體或者固體培養(yǎng)基的菌株進行菌種鑒定，以區(qū)分NTM和結核分枝桿菌。菌種鑒定的方法多樣，如表型檢測(最常見的如硝酸還原試驗、煙酸試驗)，免疫層析，基因分型等。

《手冊》[2]也指出臨床醫(yī)生必須意識到，基因型分析較表型檢測更能快速地提供可靠的菌種鑒定結果，除非確定為結核分枝桿菌屬，否則分枝桿菌的分離株對一線藥物的耐藥表型可能預示是NTM感染而并不一定是耐藥結核病。

六、DST的作用及WHO推薦技術

DST對于耐藥結核病患者及時發(fā)現(xiàn)和治療，以及耐藥結核病高危人群的篩查工作具有重要作用?！妒謨浴穂2]提出國家結核病防治規(guī)劃應該有能力對任何疑似的耐藥結核病患者提供DST服務。隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，耐藥分子檢測手段開始嶄露頭角。在基因型DST中，LPAs和Xpert Mtb/RIF是當前被WHO認可的僅有的2項用于利福平耐藥的檢測技術。例如，Xpert Mtb/RIF在利福平耐藥及MDR-TB篩查工作中的突出優(yōu)勢，使其被WHO譽為結核病診斷中的革命性突破，得以在世界范圍內(nèi)被大力推廣[9]。大多數(shù)情況下，尤其是使用一線抗結核藥物固定劑量復合制劑(FDC)時，利福平耐藥幾乎都合并異煙肼耐藥，檢測到利福平耐藥也意味著極有可能(但并非全部)是MDR-TB?？焖倮Ｆ侥退帣z測的優(yōu)勢包括MDR-TB高風險患者的快速篩查，盡早發(fā)現(xiàn)不適當?shù)囊痪€抗結核藥物治療方案，盡早阻斷MDR-TB的傳播。表型DST方法檢測耐藥不需要考慮耐藥機制及分子生物學基礎，可在固體或液體培養(yǎng)基上直接或間接進行。固體培養(yǎng)常用方法有比例法、絕對濃度和抗性比率法；液體培養(yǎng)系統(tǒng)主要是比例法，這些方法對于一線抗結核藥物有著良好的一致性。

《手冊》[2]同時提到了一些非商品化培養(yǎng)及DST檢測方法可用作臨時解決方案應用于資源有限且有待發(fā)展基因型DST檢測的實驗室。其中，顯微鏡觀察藥敏技術(MODS)、比色法、硝酸還原酶分析法(NRA)的成本較低。這些非商品化的檢測方法與常規(guī)培養(yǎng)及DST同樣需要生物安全措施，因此僅適用于中央或具備生物安全條件的區(qū)域級實驗室。二線藥物的DST，采用肉湯或液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)的比例法的檢測結果相似，但仍有待建立準確度高和可重復性強的標準方法。

《手冊》[2]指出，MDR-TB的快速分子檢測不排除對常規(guī)培養(yǎng)和藥敏試驗的需求。培養(yǎng)主要用于MDR-TB患者的療效監(jiān)測和執(zhí)行二線藥物的DST檢測。《手冊》[2]中提及的目前惟一的一個商品化的XDR-TB分子檢測方法，WHO并不建議使用。專家組在2012年評估獲得的證據(jù)認為，檢測氟喹諾酮類和二線注射藥物的MTBDRsl線性探針基因型檢測方法的特異度高、敏感度稍差，其分析結果無法確定最適合的氟喹諾酮類或注射藥物用于針對性的治療方案。當前，表型DST技術是檢測XDR-TB的參考方法。商品化的液體培養(yǎng)被認為是最快且可靠的二線藥物DST方法。

七、DST的局限性

DST的可靠性因藥物而有所不同。一線藥物的DST，利福平和異煙肼可靠性最高，鏈霉素、乙胺丁醇和吡嗪酰胺可靠性和可重復性較低(吡嗪酰胺的檢測只能在液體培養(yǎng)基調(diào)整到適當?shù)膒H值時才能進行)。二線藥物中可注射類藥物(阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素)和氟喹諾酮類藥物的可靠性和可重復性強。其他二線藥物DST可靠性和可重復性的數(shù)據(jù)有限，其中有些方法還尚未建立或者沒有標準。此外，DST相關結果對臨床預后有指導意義的數(shù)據(jù)仍不足。

利福平耐藥的表型DST和基因型DST方法不完全一致。新證據(jù)表明，rpoB基因DNA測序(基因型DST檢測的金標準)盡管并不完美但較表型DST是一個更好的參考方法。針對這一問題，WHO將繼續(xù)搜集和評估新的數(shù)據(jù)，待獲得充足數(shù)據(jù)時，將進一步評估表型耐藥檢測標準的準確性。

八、交叉耐藥

交叉耐藥及對耐藥結核病分子機制了解的不足使問題進一步復雜化。新的證據(jù)顯示，對于多數(shù)藥物的表型耐藥與特異的分子突變有著明確的聯(lián)系；但是，尚未確定所有二線藥物的耐藥突變，即便已經(jīng)檢測到的耐藥突變的分子機制也未被闡明。

基本實驗室服務、機構設置、安全與質(zhì)控

《手冊》[2]中突出了基本實驗室服務的兩項重要任務，其一是服務于臨床需求；其二是服務于整個耐藥結核病防控體系。

由于資源和能力的不平衡，實驗室需要分級提供相應的服務，以及與之配套的機構設置工作，其中最基本的是保證開展對一線抗結核藥物利福平和異煙肼進行DST。對其他抗結核藥的DST 可以根據(jù)實際情況逐級實施，并且將不同級別的實驗室聯(lián)接成服務互補的網(wǎng)絡以發(fā)揮更大的效能。為保證檢測的準確性和一致性，各實驗室都應該制訂質(zhì)量管理系統(tǒng)(quality management system，QMS)。QMS 應當包括標準操作流程(standard operating procedures，SOPs)、室內(nèi)質(zhì)控(internal quality control， IQC)及室間質(zhì)量評估(external quality assessment，EQA)等部分。此外，需要加強實驗室工作人員的培訓與工作流程監(jiān)督，以控制實驗室獲得性結核感染的發(fā)生。

結核病實驗室網(wǎng)絡的構建及臨床樣本的收集與運輸

結核病實驗室網(wǎng)絡的構建及臨床樣本收集與運輸在《手冊》[2]中分為前后兩部分進行論述，實際上這兩部分內(nèi)容是一個整體。構建結核病實驗室網(wǎng)絡的主要目的是解決資源和技術短缺，以及不能滿足實際耐藥結核病診斷需求的問題，以最大限度發(fā)揮現(xiàn)有資源和技術的效能?！妒謨浴穂2]中所提及的結核病實驗室網(wǎng)絡主要是一種樹形結構，其將實驗室從基層(level Ⅰ)到中心(level Ⅲ) 分為三級實驗室。每級實驗室均有不同的工作側重，中間有專門的樣本轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行銜接。

DST 的合理應用及報告時間

DST 的合理應用及報告時間也是《手冊》[2]中相互密切關聯(lián)的兩部分內(nèi)容。DST 的WHO 政策指南主要遵循之前發(fā)表的相關原則[10]，這些原則主要考慮到實驗室能力、DST 的準確性、臨床實際需求、防控需求、效率，以及報告時間等因素來制訂。其中，檢測報告時間是早期診斷的重要指標。不同檢測方法的報告時間也有差異，如傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法以周計、LPAs 的方法以天計，Xpert Mtb/RIF 以小時計。由于現(xiàn)有方法之間是一種互補關系，目前主要應該對各種方法進行合理的使用，同時將各種方法的檢測報告時間標準化，以使制訂的原則真正發(fā)揮效力。

總結與展望

筆者主要對《手冊》[2]有關耐藥結核病實驗室檢測部分進行了初步的解讀，對耐藥結核病實驗室檢測相關的概念和技術進行了梳理，同時對其他內(nèi)容也進行了簡要的概述。目前耐藥結核病防控形勢依然嚴峻，相關研究逐漸增多，新的診斷技術方法也不斷被引進和應用，同時相關的概念和實際檢測技術也在不斷地發(fā)展。DST檢測技術的發(fā)展并不能完全解決耐藥結核病實驗室檢測相關的全部問題，還需要從實驗室的機構設置、網(wǎng)絡形成、質(zhì)量控制、人員培訓及制訂相關規(guī)范流程等多方面進行綜合考慮。

結合我國目前耐藥結核病流行病學現(xiàn)狀，筆者認為《手冊》[2]中本章節(jié)關于實驗室檢測的相關問題及解決方案具有極高的參考價值。但由于國情不同，筆者認為仍然有很多關于耐藥實驗室檢測的特殊問題《手冊》[2]中并沒有重點提及或關注，如：在不同經(jīng)濟發(fā)展水平的地區(qū)建立相適應的實驗室構架及區(qū)域性或全國性的網(wǎng)絡；在人口大規(guī)模流動的背景下，固定的樹形實驗室網(wǎng)絡是否可以與之相適應并發(fā)揮實際的防控功能。因此，結合《手冊》[2]的相關內(nèi)容及我國實際情況，有必要進一步制訂符合我國國情的相關指南、指導手冊及政策，以更好地服務于我國的耐藥結核病防控工作。

[1] World Health Organization. Policy framework for implementing new tuberculosis diagnostics. WHO/HTM/TB/2010.07. Geneva：World Health Organization, 2010.

[2] World Health Organization. Companion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis. WHO/HTM/TB/2014.11. Geneva：World Health Organization, 2014.

[3] World Health Organization. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis-Emergency update 2008. WHO/HTM/TB/2008.402. Geneva：World Health Organization, 2010.

[4] World Health Organization. A roadmap for ensuring quality tuberculosis diagnostics services within national laboratory strategic plans. WHO/HTM/TB/2010. Geneva：World Health Organization, 2010.

[5] 張潔，邢青，王甦民，等. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法與PCR-熒光探針法鑒定分枝桿菌的對比研究. 中國防癆雜志，2015，37(3): 291-294.

[6] 王桂榮，付育紅，梁倩，等. 應用多重PCR方法快速鑒定結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌的研究. 中國防癆雜志， 2013，35(9): 686-689.

[7] World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children: policy update. WHO/HTM/TB/2011.4. Geneva：World Health Organization, 2011

[8] World Health Organization. Rapid implementation of the XpertMTB/RIF diagnostic test. WHO/HTM/TB/2011. Geneva：World Health Organization, 2011.

[9] 唐神結，許紹發(fā)，李亮. 耐藥結核病學. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：103-108.

[10] World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs. WHO/HTM/TB/2008. Geneva: World Health Organization, 2008.

(本文編輯：薛愛華)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.018

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學發(fā)展專項經(jīng)費資助(ZYLX201304)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病研究北京市重點實驗室細菌免疫學研究室

李傳友，Email:lichuanyou6688@hotmail.com

2015-05-04)