一種復(fù)合益生菌對斜帶石斑魚生長及免疫特性影響的研究

■李小梅 楊麗冬 張家學(xué) 舒 琥 張海發(fā)

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究院，廣東廣州511400；3.廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心，廣東惠州516081)

近年來，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）已成為我國廣東、福建和海南等地重要的養(yǎng)殖品種之一。在斜帶石斑魚人工養(yǎng)殖過程中，細(xì)菌、病毒或寄生蟲等引起的病害防治和管理工作十分迫切，尤其對于養(yǎng)殖密度較大或者養(yǎng)殖高度集中、更容易造成病害發(fā)生和流行的網(wǎng)箱養(yǎng)殖場，漁民們不得不依賴抗生素來進(jìn)行石斑魚病害防治，而抗生素的濫用導(dǎo)致了嚴(yán)重的食品安全問題。因此，要從根本上解決石斑魚等經(jīng)濟(jì)魚類的病害、食品安全問題，需要開發(fā)使用優(yōu)質(zhì)餌料、合理選用免疫制品、結(jié)合科學(xué)防病等措施來提高養(yǎng)殖魚類機(jī)體的抗病力；因此，預(yù)防為主，進(jìn)行石斑魚的生態(tài)健康養(yǎng)殖非常必要[1-3]。

本研究擬開發(fā)一種復(fù)合益生菌飼料添加劑，探討其對斜帶石斑魚生長及非特異性免疫特性相關(guān)指標(biāo)的影響，為石斑魚病害防治的益生菌制劑開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚由廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心提供；實(shí)驗(yàn)飼料包括基礎(chǔ)飼料（系市售東丸牌石斑魚配合飼料）、乳化魚油包裹飼料（由2%飼料量的乳化魚油包裹基礎(chǔ)飼料）和復(fù)合菌飼料（復(fù)合菌飼料由基礎(chǔ)飼料與不同用量的復(fù)合益生菌混勻，再以2%飼料用量的乳化魚油包裹制得）。實(shí)驗(yàn)用復(fù)合益生菌為：20%光合細(xì)菌（Rhodop seudanonas palustris）菌液、2%短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）菌粉和78%嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）菌液混合組成（按照質(zhì)量百分比），每10 g復(fù)合菌含2.0 ml光合細(xì)菌菌液、0.2 g短小芽孢桿菌菌粉和7.8 ml嗜酸乳桿菌菌液。實(shí)際操作是，先將短小芽孢桿菌菌粉混合到嗜酸乳桿菌菌液中，再將其與光合細(xì)菌菌液混合均勻制得。

實(shí)驗(yàn)用益生菌由廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究院提供；其中，光合細(xì)菌、嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌的有效活菌數(shù)分別為1.0×109、1.0×109cfu/g和2.0×109cfu/g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組及石斑魚養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚初始體質(zhì)量為(64.69±8.65)g，隨機(jī)分為對照組、乳化魚油組和復(fù)合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組共5組，每組設(shè)3個平行，每個平行10尾魚，共150尾魚；對照組投喂基礎(chǔ)飼料，乳化魚油組投喂乳化魚油包裹飼料，復(fù)合益生菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別投喂對應(yīng)的復(fù)合菌飼料，其中復(fù)合菌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組飼料分別由每千克基礎(chǔ)飼料添加10、30 g和50 g復(fù)合菌混合均勻制得。

每日定時(shí)定量投喂，投喂率為體重的2%。各復(fù)合益生菌飼料組的飼料準(zhǔn)備在飼喂前30 min完成；飼喂實(shí)驗(yàn)共30 d。

養(yǎng)殖池水體采用沙濾海水，池內(nèi)為對流式進(jìn)出水；實(shí)驗(yàn)期間保持養(yǎng)殖池的連續(xù)充氣狀態(tài)，于廣東大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心的水泥池網(wǎng)箱中進(jìn)行養(yǎng)殖。

1.2 指標(biāo)及測定方法

1.2.1 生長性能指標(biāo)測定

對飼喂30 d的實(shí)驗(yàn)斜帶石斑魚進(jìn)行稱重和測量體長。

體增重率(%)=[(試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初體重)/試驗(yàn)初體重]×100；

體增長率(%)=[(試驗(yàn)?zāi)w長-試驗(yàn)初體長)/試驗(yàn)初體長]×100；

飼料系數(shù)=投喂量/(試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初體重)；

肥滿度（g/cm3）=100×（體重/體長3）。

1.2.2 血清中免疫相關(guān)酶活性的測定

于飼喂石斑魚的第30 d進(jìn)行血清取樣，取樣前1 d停止投喂飼料；每組取20尾魚，采用穿刺尾動脈法取血，采集的血樣置于4℃冰箱靜置4 h，然后以10 000 r/min離心10 min，收集上層血清測定酶活。血清總超氧化物歧化酶（SOD）、血清總抗氧化酶（TAOC）、血清酸性磷酸酶（ACP）、血清堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活力測定均按相應(yīng)試劑盒方法進(jìn)行（試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號均為20130918）。

1.2.3 攻毒實(shí)驗(yàn)

對石斑魚進(jìn)行稱重和體長測量結(jié)束后，用哈維氏弧菌活菌菌懸液（1×108cfu/ml）通過腹腔注射進(jìn)行攻毒，實(shí)驗(yàn)組石斑魚各10尾，0.2 ml/尾，然后置于干凈的水族缸內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察10 d，飼養(yǎng)條件和注射前相同，每天多次觀察和記錄石斑魚的發(fā)病和死亡情況，對死亡的石斑魚進(jìn)行解剖、細(xì)菌分離并確認(rèn)死因。按照以下公式計(jì)算：

免疫保護(hù)率(%)=[1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

測定結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對石斑魚生長性能的影響(見表1)

由表1可知，與對照組相比，乳化魚油組的斜帶石斑魚體增重率、體增長率、肥滿度和飼料系數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）；與對照組和乳化魚油組相比，復(fù)合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組石斑魚的體增重率與體增長率均顯著提高（P＜0.05），肥滿度均顯著提升（P＜0.05），飼料系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。由此說明，斜帶石斑魚生長特性顯著性差異來源于復(fù)合益生菌的作用，也就是說，基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的復(fù)合益生菌制得的飼料均可以有效改善石斑魚的生長特性，并提高飼料利用率。值得提出的是，不同復(fù)合益生菌用量的Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組間石斑魚的體增重率、體增長率、肥滿度、飼料系數(shù)等差異性均不顯著（P＞0.05）。

表1 復(fù)合益生菌對斜帶石斑魚的促生長作用（X±SD，n=20）

2.2 復(fù)合益生菌對石斑魚血清中免疫相關(guān)酶活性的影響(見表2)

由表2可知，與對照組相比，乳化魚油組石斑魚血清AKP、ACP、總SOD、T-AOC和溶菌酶活力與對照組無顯著差異(P＞0.05)；而復(fù)合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組石斑魚的血清AKP、ACP活力均顯著升高(P＜0.05)，總SOD、TAOC、溶菌酶活力呈極顯著性升高(P＜0.01)；復(fù)合益生菌Ⅲ組的ACP活力呈顯著性升高(P＜0.05)，AKP、總SOD、T-AOC、溶菌酶活力呈極顯著性升高(P＜0.01)。但與乳化魚油組相比，復(fù)合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組斜帶石斑魚的血清AKP、ACP、T-AOC、溶菌酶活力均顯著升高(P＜0.05)，總SOD活力呈極顯著性升高(P＜0.01)。

表2 復(fù)合益生菌對斜帶石斑魚免疫相關(guān)酶活性的影響（X±SD，n=20，U/ml）

由此說明，添加益生菌可有效提高斜帶石斑魚部分非特異免疫特性的作用，包括增加血清AKP、ACP、T-AOC和溶菌酶活力和增加血清總SOD活力。復(fù)合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之間石斑魚AKP、ACP、總SOD、T-AOC和溶菌酶活力均無顯著性差異（P＞0.05）。這說明，基礎(chǔ)飼料中添加3種不同劑量的復(fù)合益生菌均可增強(qiáng)石斑魚的非特異性免疫功能，但不同用量組間差異不顯著。

2.3 復(fù)合益生菌對攻毒后石斑魚成活的影響（見表3）

表3 復(fù)合益生菌對斜帶石斑魚攻毒后的影響（n=10，%）

如表3所示，復(fù)合益生菌飼料投喂攻毒后斜帶石斑魚，在復(fù)合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別較對照組存活率高30.0～40.0個百分點(diǎn)，較乳化魚油組存活率提高20.0～30.0個百分點(diǎn)；復(fù)合益生菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別較乳化魚油組的免疫保護(hù)率提高40.0個百分點(diǎn)以上，最高達(dá)到60.0個百分點(diǎn)。

由此可見，基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合益生菌可明顯提高對攻毒石斑魚的免疫保護(hù)作用，從而提高了攻毒石斑魚的存活率。

3 討論

本研究中，以復(fù)合益生菌飼料飼喂斜帶石斑魚30 d，均表現(xiàn)出明顯促進(jìn)了石斑魚的生長和飼料利用率的提升。就組成復(fù)合益生菌的菌種而言，光合細(xì)菌、短小芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌均屬水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌，已分別有促進(jìn)魚類生長的文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，但未見將這3種菌一起復(fù)配的相關(guān)研究。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不同的是，本實(shí)驗(yàn)用乳化魚油將復(fù)合益生菌包裹于飼料表面，避免了投喂時(shí)菌體快速分散于水中而流失，從而保證了復(fù)合菌與飼料顆粒一起能被實(shí)驗(yàn)魚充分有效攝食；乳化魚油組斜帶石斑魚的各項(xiàng)指標(biāo)較對照組均未構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性，由此提示，乳化魚油包裹可作為益生菌拌料的可行方式。

魚類在抵抗病害感染時(shí)，機(jī)體的非特異性免疫會發(fā)揮十分重要作用，免疫相關(guān)酶的活性會被激活[8-9]。在魚類等低等脊椎動物及軟體動物中，SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，AKP作為重要的代謝調(diào)控酶，ACP作為溶酶體酶的重要組成部分，它們保證了溶酶體有效完成防御和消化的雙重功能，T-AOC在抗氧化調(diào)節(jié)方面起重要作用,溶菌酶則是魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。若魚體內(nèi)上述幾種酶活力提升，則機(jī)體抗病力顯著增強(qiáng)。

本研究表明，飼喂復(fù)合益生菌后石斑魚血清中有5種免疫相關(guān)酶的活性均顯著升高，可見魚體免疫功能從多途徑方面得以增強(qiáng)，從而保證其健康生長。該復(fù)合益生菌體現(xiàn)出的增強(qiáng)免疫功效可能與菌種的選擇、菌種量或菌種復(fù)配方法等有關(guān)。復(fù)合菌中的光合細(xì)菌菌液中富含自身代謝產(chǎn)生的免疫多糖及輔酶Q10，具有良好免疫刺激活性及抗氧化活性[10]；短小芽孢桿菌能產(chǎn)生高抑制弧菌活性的細(xì)菌素，對水產(chǎn)上常見主要致病菌有良好的拮抗效果[5]；嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸能力和分泌乳酸菌素的能力強(qiáng)，可黏附于魚腸道表皮細(xì)胞，酸化腸道，刺激腸道免疫和抑制病原菌[7]。這三種菌復(fù)配時(shí)，光合細(xì)菌菌液偏堿性且含有高含量的黏多糖，嗜酸乳桿菌菌液呈酸性，而短小芽孢桿菌具有一定的緩沖能力和酸中和能力，因此，先將嗜酸乳桿菌與短小芽孢桿菌混合，有助于減少pH值的瞬間變化對嗜酸乳桿菌和光合細(xì)菌的影響，同時(shí)利于增加混合均勻度。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的復(fù)合益生菌不僅綜合了各組成菌的優(yōu)良特性，同時(shí)促進(jìn)了不同菌之間的互作，如光合細(xì)菌的代謝產(chǎn)物能促進(jìn)嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌的繁殖，短小芽孢桿菌在石斑魚體內(nèi)快速繁殖降低腸道氧化還原電位，為嗜酸乳桿菌的增殖創(chuàng)造良好的厭氧環(huán)境。

斜帶石斑魚以哈維氏弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂復(fù)合益生菌的魚死亡出現(xiàn)時(shí)間延后，且死亡率明顯低于對照組，這進(jìn)一步體現(xiàn)了復(fù)合益生菌具備良好的增強(qiáng)免疫效果。

最后，三種不同劑量的復(fù)合益生菌飼喂斜帶石斑魚后，組間的生長性能指標(biāo)與免疫特性指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別，即未呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)，這可能與實(shí)驗(yàn)中選擇的劑量水平有關(guān)，實(shí)驗(yàn)中各菌種的菌數(shù)水平較高，分別達(dá)到109cfu/g。若基于性價(jià)比最優(yōu)或安全性劑量水平考慮，最適復(fù)合益生菌添加水平需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。