金訶子低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑制作用觀察

趙小霞，邱麗君，蘇衛(wèi)東，宣成睿，孫鵬，楊麗敏

(1天津市第四中心醫(yī)院，天津300140;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué))

訶子又名訶黎勒、訶黎、訶梨、隨風(fēng)子等，為君子科植物訶子及其變種絨毛訶子干燥的成熟果實(shí)，其味澀、性平，可祛三弊所引起的諸疾，有解毒之功效。文獻(xiàn)［1～4］報(bào)道，訶子對(duì)多種致病菌和病毒有抑制和殺滅作用，是一種抗菌譜較廣的單味藥材。金訶子是訶子當(dāng)中的最佳品種，色顯金黃，故名為金訶子，具有澀腸止瀉、利咽、調(diào)和藥性、解毒等功效。本研究觀察了金訶子不同部位低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株(大腸桿菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌)在體外及體內(nèi)試驗(yàn)中的抑制作用，旨在為金訶子的成分、藥效研究及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物、菌株、動(dòng)物及儀器 金訶子5種低溫提取物由本課題組自行制備，分別稱為1號(hào)部位、2號(hào)部位、3號(hào)部位、4號(hào)部位、5號(hào)部位，具體提取工藝見文獻(xiàn)［5］;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司;胃膜素購于重慶格瑞林藥業(yè)有限公司。大腸桿菌(細(xì)菌編號(hào):25922)、痢疾桿菌(細(xì)菌編號(hào):51285)、假單胞綠膿菌(細(xì)菌編號(hào):27853)、變形桿菌(細(xì)菌編號(hào):49001)、白色葡萄球菌(細(xì)菌編號(hào):26101)、金黃色葡萄球菌(細(xì)菌編號(hào):25923)購于中國生物制品檢定所。昆明鼠360只，18～22 g，雌雄各半，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物室。DZG-303A離子純水機(jī)購于美國摩爾公司;培養(yǎng)箱購于日本日立公司;顯微鏡購于德國Leica公司;電子天平購于上海精科天平公司;PYX-DHS-35隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海醫(yī)療器械七廠。

1.2 金訶子低溫提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn) 將凍干的6種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代3代，后用密集劃線法將每種菌株接種至1個(gè)固體培養(yǎng)皿中(共計(jì)6個(gè)培養(yǎng)皿)，將4個(gè)無菌鋼杯等間距對(duì)稱置于每個(gè)培養(yǎng)皿中。分別稱取一定量的5種金訶子提取物(1號(hào)部位、2號(hào)部位、3號(hào)部位、4號(hào)部位、5號(hào)部位)，每種金訶子提取物用0.45%鹽水配制成4種濃度，即 0、5、15、30 mg/mL，0.22 μm 微孔濾膜濾過除菌，每個(gè)鋼杯中加入200 μL，藥物含量分別為0、1、3、6 mg(共計(jì)30個(gè)培養(yǎng)皿)。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈直徑，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量數(shù)據(jù)，單位為mm。

1.3 金訶子低溫提取物體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn) 360只小鼠建立6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的感染小鼠模型，小鼠腹腔注射含有5%胃膜素和致死劑量的標(biāo)準(zhǔn)菌株，每種模型60只。然后每種模型取10只小鼠灌胃給予0.45%鹽水1 mL(對(duì)照組)，另50只小鼠分別灌胃40 mg/mL金訶子低溫提取物1 mL，每種提取物灌胃10只小鼠(分別為1號(hào)部位、2號(hào)部位、3號(hào)部位、4號(hào)部位、5號(hào)部位組)，給藥后觀察24 h，觀察小鼠存活情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金訶子低溫提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表1。由表1可知，金訶子5種提取物在體外對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株均有生長抑制的作用(P均＜0.05)。

2.2 金訶子低溫提取物體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表2。

表1 金訶子低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈直徑比較(mm，±s)

表1 金訶子低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈直徑比較(mm，±s)

金訶子低溫提取物抑菌圈直徑大腸桿菌 痢疾桿菌 假單胞綠膿菌 變形桿菌 白葡球菌 金葡球菌1號(hào)部位1 mg 8.3 ±1.0 10.5 ±0.2 14.3 ±0.3 8.7 ±0.3 9.5 ±0.4 10.6 ±0.3 3 mg 8.6 ±0.4 12.4 ±0.4 15.4 ±0.3 10.6 ±0.3 11.2 ±0.2 12.4 ±0.6 6 mg 13.5 ±0.6 14.4 ±0.2 22.3 ±0.5 10.6 ±0.2 14.5 ±0.2 14.3 ±0.4 2號(hào)部位1 mg 0 11.6 ±0.2 14.6 ±0.6 7.4 ±0.3 8.6 ±0.3 7.3 ±0.5 3 mg 7.4 ±0.6 12.6 ±0.4 14.6 ±0.3 11.6 ±0.3 10.3 ±0.3 8.4 ±0.7 6 mg 9.3 ±0.5 16.2 ±0.3 22.4 ±0.7 9.6 ±0.3 13.2 ±0.2 10.9 ±0.5 3號(hào)部位1 mg 8.5 ±0.5 11.7 ±0.2 16.7 ±0.5 7.8 ±0.3 8.4 ±0.4 8.4 ±0.4 3 mg 9.4 ±0.4 13.2 ±0.3 18.5 ±0.4 10.7 ±0.2 10.7 ±0.4 9.4 ±0.3 6 mg 12.4 ±0.6 16.5 ±0.2 24.5 ±0.3 9.7 ±0.3 11.8 ±0.4 12.4 ±0.2 4號(hào)部位1 mg 10.8 ±0.3 11.8 ±0.4 15.7 ±0.3 9.5 ±0.4 8.5 ±0.4 8.3 ±0.6 3 mg 11.7 ±0.3 12.5 ±0.4 17.8 ±0.4 11.6 ±0.4 11.4 ±0.4 10.3 ±0.3 6 mg 15.6 ±0.4 16.8 ±0.2 23.2 ±0.5 12.5 ±0.4 11.5 ±0.4 12.3 ±0.4 5號(hào)部位1 mg 8.2 ±0.2 8.9 ±0.3 11.4 ±0.4 15.3 ±0.5 15.4 ±0.3 15.2 ±0.3 3 mg 10.5 ±0.3 10.6 ±0.5 13.6 ±0.2 15.6 ±0.4 15.4 ±0.3 15.3 ±0.3 6 mg 13.4 ±0.8 10.2 ±0.4 15.8 ±0.3 15.6 ±0.3 15.4 ±0.2 15.6 ±0.3

表2 金訶子低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株感染的小鼠存活率的影響(%，±s)

表2 金訶子低溫提取物對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株感染的小鼠存活率的影響(%，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01。

組別小鼠存活率大腸桿菌 痢疾桿菌 銅綠假單胞菌 變形桿菌 白色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌1 號(hào)部位組 56.67 ±4.71* 63.33 ±9.43* 63.33 ±9.43* 16.67 ±4.71* 66.67 ±4.71* 66.67 ±4.71*2 號(hào)部位組 56.67 ±4.71* 63.33 ±9.43* 63.33 ±9.43* 23.33 ±4.71* 60.00 ±0.00* 23.33 ±4.71*3 號(hào)部位組 56.67 ±4.71* 56.67 ±4.71* 56.67 ±4.71* 36.67 ±4.71* 56.67 ±4.71* 70.00 ±0.00*4 號(hào)部位組 60.00 ±0.00* 56.67 ±4.71* 50.00 ±0.00* 23.33 ±4.71* 66.67 ±4.71* 53.33 ±4.71*5 號(hào)部位組 36.67 ±4.71* 36.67 ±4.71* 36.67 ±4.71* 13.33 ±4.71* 40.00 ±8.16* 36.67 ±4.71*對(duì)照組000000

3 討論

我國是植物藥的大國，在抗生素出現(xiàn)之前，我國的傳統(tǒng)中藥已在治療感染疾病方面發(fā)揮了重要的作用，所以篩選有抑菌作用的中藥具有了一定的優(yōu)勢(shì)，且植物藥的不良反應(yīng)小，它不僅具有抗菌作用，同時(shí)還具有滋補(bǔ)、調(diào)理等其他藥用功效，但是由于中藥種類繁多，且都具有自己獨(dú)特的作用機(jī)制，而且目前沒有一個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行成分測(cè)定，所以中藥的國際化受到了限制［6］。本研究前期工作已經(jīng)優(yōu)化了金訶子的提取工藝，制定了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，并探討了金訶子低溫提取物的免疫增強(qiáng)作用和抗腫瘤作用［5，7，8］。訶子是一種抗菌譜較廣的單味藥材，其對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性桿菌、幽門螺桿菌及部分真菌等都有抑制作用。Kannan等［2］對(duì)訶子甲醇提取物進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示訶子甲醇提取物對(duì)沙門傷寒桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌以及綠膿假單胞菌和克雷伯桿菌等菌株有高度敏感性，在1 mg/mL的低濃度即顯示了較強(qiáng)的抑菌能力。Bag等［3］比較研究了訶子冷水、熱水、乙醇3種溶劑提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧嘧啶(SXT)/磺胺甲唑(TMP)的大腸桿菌的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)訶子的3種提取物均有不同程度的抗菌活性，冷水提取物抗菌活性最弱，熱水提取物對(duì)MRSA的抗菌活性最強(qiáng)，而乙醇提取物對(duì)耐SXT/TMP的大腸桿菌的抗菌活性最強(qiáng)。

因?yàn)橹嗅t(yī)傳統(tǒng)中主要采用水煎的方法熬制中藥，所以本研究傳承中藥的傳統(tǒng)水提取方法，同時(shí)改進(jìn)工藝低溫提取金訶子，獲得5種不同物理性狀、色澤和味道的提取物。本提取工藝可有效提取金訶子不同部位成分，消除雜質(zhì)及無用部分，確保用藥安全可靠［7］。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金訶子5種低溫提取物均有抑菌活性，且5號(hào)部位對(duì)于革蘭陽性菌的抑菌作用優(yōu)于革蘭陰性菌，其余4個(gè)部位對(duì)于選擇的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑制作用無顯著性差異。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金訶子5種低溫提取物均可提高模型鼠的存活率，但5號(hào)部位的體內(nèi)抑菌作用較弱，5個(gè)部位對(duì)變形桿菌的體內(nèi)抑菌效果均最差，具體的抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

［1］劉芳，秦紅飛，劉松青.訶子化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2012，23(7):670-672.

［2］Kannan P，Ramadevi SR，Hopper W.Antibacterial activity of terminalia chebula fruit extract［J］.Afr J Microbiol Res，2009，3(4):180-185.

［3］Bag A，Bhattacharyya SK.Evaluation of antibacterial properties of chebulic myrobalan(fruit of terminalia chebula of terminalia chebula fruit extract retz)extracts against methicillin resistant Staphylococcus aureus and trimethoprim-sulphamethoxazole resistant uropathogenic escherichia coli［J］.Afr J Plant Sci，2009，3(2):25-28.

［4］Mann A.Antibacterial activity of terpenoidal fractions from anogeissus leiocarpus and terminalia avicennioides against community acquired infections［J］.Afr J Pharm Pharmaco，2009，3(1):22-26.

［5］羅夏，宣成睿，趙小霞，等.兩種方法對(duì)蒙藥金訶子低溫提取物多糖成分和含量測(cè)定結(jié)果比較［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(29):27-29.

［6］陳代杰.全球抗菌藥研發(fā)背景概況及對(duì)加快我國抗菌藥研發(fā)的思考［J］.上海醫(yī)藥，2012，33(19):7-8.

［7］趙小霞，邱麗君，宣成睿，等.金訶子低溫提取物的免疫活性［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(37):21-23.

［8］包志強(qiáng)，韓浩，楊麗敏，等.訶子水提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞抑制作用的研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20(9):1783-1786.