基質金屬蛋白酶-2、14及RECK基因在涎腺多形性腺瘤的初發(fā)、復發(fā)及惡變中的表達及意義

阿依努爾·艾比布拉，尹小朋，龔忠誠，劉 慧，凌 彬，克熱木·阿巴斯，胡露露，寧曉婷，楊 萌，陳青立，林兆全

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所新疆烏魯木齊830054）

基質金屬蛋白酶-2、14及RECK基因在涎腺多形性腺瘤的初發(fā)、復發(fā)及惡變中的表達及意義

阿依努爾·艾比布拉，尹小朋，龔忠誠，劉 慧，凌 彬，克熱木·阿巴斯，胡露露，寧曉婷，楊 萌，陳青立，林兆全

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所新疆烏魯木齊830054）

目的：研究基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase 14，MMP-14）和RECK基因在涎腺多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）初發(fā)患者、復發(fā)患者及進一步惡變患者組中的表達及其意義。方法：研究對象為新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科2004年至2014涎腺PA手術標本50例，其中初發(fā)36例，惡變7例，復發(fā)7例和10例正常腮腺組織（10例均來自腮腺）。通過免疫組織化學方法檢測RECK、MMP-2和MMP-14在各組標本中的表達，并采用半定量方法進行計量。對RECK與MMP-2及MMP-14在各組中的表達采用SPSS 21.0軟件包對數據進行統(tǒng)計學分析。結果：MMP-2在正常組與復發(fā)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），正常組與惡變組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），初發(fā)組與復發(fā)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），初發(fā)組與惡變組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RECK與MMP-2和MMP-14在各個組的表達都呈負相關（r=-0.887，P＜0.05；r=-0.798，P＜0.05）。結論：臨床上，在涎腺PA惡變，復發(fā)組織同時對RECK與MMP-2的進行檢測分析其有重要意義，這對于判別腫瘤侵蝕性和預后指標是極有可能。

涎腺；多形性腺瘤；MMP-2；MMP-14；RECK；免疫組化

多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）是涎腺腫瘤中臨床常見的，在好發(fā)部位中，腮腺不但是其中最主要，也是最經常見的，復發(fā)和有惡變的可能性較大，然而，這個部位發(fā)生、復發(fā)和惡變的機理都還缺乏清晰的認識。在惡性腫瘤的侵蝕和轉移中，施展重要作用的是基質金屬蛋白酶類（Matrix metalloproteinases，MMPs），在MMPs家族中，MMP-2和MMP-14是較為重要的的成員，它可以通過降解細胞外基質，緊接著破害機體抵抗腫瘤浸潤與轉移的能力，進而使得腫瘤的浸潤性增加［1］?；啄ひ财鹬嗤淖饔?。半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）是一種腫瘤抑制基因，是一類抑制劑，起著特殊的抑制基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）活性的作用，可以在轉錄后水平抑制多種MMPs的表達能力［2］。本實驗利用免疫組化方法，通過檢測正常腮腺組織、涎腺PA初發(fā)患者、復發(fā)患者和惡變患者組織中RECK與MMP-14和MMP-2中的表達，對比其表達意義，為臨床判別腫瘤的侵襲性和預后提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

材料來源于2014年度新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面外科腮腺多形性腺瘤（來自腮腺來源）手術切除標本50例，其中包括初發(fā)36例，惡變7例，復發(fā)7例和10例正常腮腺組織（10例均來自腮腺）本次實驗所用標本都未經術前化療，放療史的標本組織也經病理證實。研究所用人的離體標本，都通過了新疆醫(yī)科大學倫理審查委員會審批，50例患者都同意此次實驗，還簽訂了知情同意書。實驗中所有標本組織均采用10%福爾馬林固定，并用常規(guī)石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片。

1.2 方法

以PBS代替一抗作為陰性對照，以舌癌組織切片作為陽性對照。采用免疫組化SP染色法對指標的表達進行驗證。

1.2.1 試劑：兔抗MMP-14單克隆抗體；兔抗基質金屬蛋白酶-2單克隆抗體；鼠抗人RECK單克隆抗體（1: 100）；DAB顯色試劑盒（上述實驗試劑均購自博士德生物、博奧森及北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2.2 設備：37℃恒溫孵育箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；烘箱；切片機；雙目顯微鏡及BH-2顯微照相系統(tǒng)。

1.2.3 實驗方法和步驟：①將切好的片子，52℃烘箱中烘烤過夜；②脫蠟、水化：脫蠟前，將片子于室溫中放置60min，然后雙蒸水洗片子，5min/次，共3次；③去除內源性過氧化物酶，3%雙氧水室溫孵育10min；④雙蒸水沖洗片子，PBS將其浸泡5min；⑤0.01mol/L構櫞酸緩沖液（pH=6.1）微波抗原修復10min，室溫冷卻，蒸餾水沖洗，PBS浸泡；⑥37℃孵育片子15min，然后甩干；⑦滴加RECK、MMP-2或MMP-14一抗稀釋液，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，3min×3次，每個期以PBS液替代一抗；⑧將生物素化二抗液滴加于片子上，37℃恒溫烘箱孵育25min；⑨用PBS沖洗切片，3min×3次；⑩DAB顯色劑顯色切片；?自來水滴于片子上，用于終止顯色；?蘇木素復染切片5min，雙蒸水沖洗切片，鹽酸乙酸分化返藍、脫水；?烘干切片，中性樹膠封片、顯微鏡觀察目標蛋白的表達。

1.2.4 結果判定：RECK、MMP-14、MMP-2的著色部位在細胞質。400倍鏡下觀察細胞數，取5個視野數細胞數，并計算陽性細胞與總細胞數的比值。觀察過程中，陽性反應是細胞核或細胞漿內出現較為明顯的棕黃色或者棕褐色顆粒為準，并且要求背景干凈。陽性分級標準：陰性（-）：＜10%，弱陽性（+）：≥10%，陽性（++）：≥30%，強陽性（+++）：≥50%。

1.2.5 統(tǒng)計學分析：采用Excel輸入數據，SPSS21.0統(tǒng)計軟件包對結果來進行統(tǒng)計學分析。對于有序的等級資料，采用Ridit分析方法，并將其進行特定的轉化，變成連續(xù)型資料（R值）：將轉換后的數據進行單因素方差分析的F檢驗，分析正常、初發(fā)、復發(fā)、惡變四組總體上是否有統(tǒng)計學意義，四組間的兩兩比較采用LSD檢驗；當F值無意義時，則不進行組間兩兩比較。統(tǒng)計水準設定為0.05，P＞0.05表明差異無統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ridit分析結果

從表1可知，本實驗將實驗組分別與標準組（0.5）相比，比較前提是把R均值看成是MMP-2的評價指標，復發(fā)組與惡變組的可信區(qū)間包含0.5，表明復發(fā)組與惡變組的MMP-2表達與標準組無統(tǒng)計學意義。從總體上看，F=3.658，P＜0.05，可以從總體上認為四組中MMP-2在的陽性表達率比較差異具有統(tǒng)計學意義。剩余兩組有統(tǒng)計學意義。其中初發(fā)組結果為0.36，比正常組高。通過兩兩比較發(fā)現正常組與復發(fā)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），正常組與惡變組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），初發(fā)組與復發(fā)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），初發(fā)組與惡變組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從圖1可以直觀的看出正常組與初發(fā)組的均值明顯小于復發(fā)和惡變組；而正常組和初發(fā)組相近，復發(fā)組與惡變組相近。

2.2 從表2可以看出，本實驗把R均值看作是MMP-14的評價指標，其余幾組分別與標準組（0.5）相比較，四組可信區(qū)間均包含0.5，表明四組MMP-14表達與標準組均無統(tǒng)計學意義。根據4組比較F=2.205，P=0.098，大于0.05，可以認為MMP-14在四組的陽性表達率差別無統(tǒng)計學意義。

2.3 以R均值作為RECK的評價指標，各組分別與標準組（0.5）相比，正常組與惡變組的可信區(qū)間不包含0.5，表明正常組與惡變組的RECK表達與標準組相比，差異有統(tǒng)計學意義。其余2組均無統(tǒng)計學意義。從表3可知，正常組RECK表達最高為0.78，惡變組最低為0.26。根據4組比較F=7.177，P＜0.05，說明通過比較四組中RECK的陽性表達率，差別具有統(tǒng)計學意義。兩兩比較發(fā)現正常組與初組、復發(fā)組、惡變組差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。從圖3可以直觀的看出正常組與惡變組的均值有明顯差異；而復發(fā)組和初發(fā)組相近。

2.4 相關性分析

由表4、表5可知，Spearman分析結果表明，正常腮腺、涎腺PA初發(fā)、復發(fā)、惡變組織中，RECK的陽性表達率與MMP-2和MMP-14的陽性表達率均呈負相關（r=-0.887，P＜0.05；r=-0.798，P＜0.05）。

3 討論

本次研究選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院PA手術患者，總共手機標本50例。涎腺多形性腺瘤初發(fā)患者、復發(fā)患者、惡變患者的組織都包含在內，實驗結果較有代表性和說服力。

統(tǒng)計結果表明MMP-2在正常腮腺組織、PA復發(fā)、初發(fā)及惡變標本中表達呈區(qū)組性，表現為復發(fā)和惡變組MMP-2高于正常和初發(fā)組。目前認為，MMPs能在腫瘤浸潤轉移中受到重視［3］，原因是能降解ECM的蛋白成分，破壞腫瘤細胞的侵襲，同時促進腫瘤血管新生，促進腫瘤的生長和擴散［4］。本次實驗顯示，MMP-2蛋白在復發(fā)和惡變組的表達明顯高于正常和初發(fā)組，說明MMP-2參與腫瘤向外浸潤、擴展的過程。國外學者在MMP-2在乳腺癌表達時也證明這一觀點［5-6］。

MMP-14屬于膜型MMPs。綜合最新研究表明其在腫瘤浸潤轉移的作用主要表現為：①降解細胞外基質；②激活MMP-2酶源，可以認為是水解的放大作用；③以細胞間粘附分子的橋梁，可以影響細胞的遷徙［7］；④促進血管形成。有學者研究表明MMP-14可以調節(jié)VEGF的表達，促進內皮細胞的轉移［8］。多種腫瘤組織中均有MMP-14蛋白及mRNA的表達結果呈陽性，說明其表達相對于正常組織是過量的，且其與MMP-2的表達呈協(xié)同作用，表明這兩種蛋白共同對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著促進作用［9-13］。本研究中，MMP-14在各組中差異無統(tǒng)計學意義，筆者對這此結果保持審視態(tài)度，不對MMP-14的臨床檢查意義下否定結論，出現此種情況可能與正常組和初發(fā)組樣本數在總樣本數所占比例較高有關。

1998年日本學者Takahashi等發(fā)現的一種新的基質金屬蛋白酶（MMP）抑制劑--RECK基因。它是由v-Ki-ras基因轉染到小鼠的纖維原細胞（NIH/ 3T3），經過克隆得到［14］。RECK的作用主要可以歸納為兩方面：①抑制腫瘤轉移和侵襲；②抑制血管表達［15］。Akira等的研究表明RECK可抑制MMP-2和MMP-7介導的纖維結合蛋白的降解［16］。Norihir等在對肺癌患者的研究表明RECK的表達與癌癥浸潤呈正相關關系，由此可以得出的結論是RECK通過抑制基質金屬蛋白酶來使得癌癥轉移［17］。RECK基因表達抑制血管生成的研究中，Takeuchi等證實RECK基因能阻礙血管內皮因子的表達，但這種情況只有在內皮血管生長因子高度表達時才得以體現［18］。本次研究表明RECK在正常組的表達明顯高于其他各組，而惡變組的表達低于正常、初發(fā)組。在相關關系上，RECK基因表達與MMP-2和MMP-14呈反比，可以推測RECK基因可抑制MMP-2和MMP-14的表達。

綜合以上，筆者可以認為，臨床上，在涎腺PA惡變，復發(fā)組織同時對RECK與MMP-2的進行檢測分析其有重要意義，這對于判別腫瘤侵蝕性和預后指標是極有可能。

［1］龍華，周波.MMP-2和MMP-14在視網膜母細胞瘤中表達及意義［J］.國際眼科雜志，2011，11（10）:1719-1721.

［2］Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al.RECK--a newlydiscovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26（3-4）:675-683.

［3］Sledge GW.Implications of the new biology for the rapy in breast cancer［J］.Semin Oncol，1996，23（1 Suppl2）:76-81.

［4］Basset P，Okada A，Chenard MP.Matalloproteinase as stromaleffectors of human carcinoma progression: therapeutic implications［J］.Matrix Bio，1997，15（8-9）：535-540.

［5］Ones JL，Glynn P，Walker RA.Expression of MMP-2 and MMP-9.Their inhibit ors，and the activator MTI-MMP in primary breast carcinomas［J］.Pathol，1999，189（2）:161-168.

［6］Nakopoulou L，Tsirmpa I，Alexandrou P，et al.MMP-2 protein in invasive breast cancer and the impact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall survival［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，77（2）:145-155.

［7］胡興勝，文世民，鄒心怡，等.MMP14在非小細胞肺癌中的表達及其與預后的關系［J］.生命科學研究，2012，16（4）:329-332.

［8］B0rrirukwanit K，Lafleur MA，Mercurif A，et al.The type 1 collagen induction of MT1-MMP-mediated MMP-2 activation is repreased by alpha Vbeta3 integrin in human breast cancer cells［J］.Matrix Biology，2007，26（4）291-305.

［9］Nawrocki B，Polette M，Marchand V，et al.Expression of matrix mataIIoproteinase and their inhibitors in human bronchopulmonary carcinomas：Quantificative and morphological analysis［J］.Int J Cancer，1997，72：556-564.

［10］Mori M，Mimori K，ShIraishi T，et al.Analysis of MTl-MMP and MMP-2 expression in human gastric cancers［J］.Int J Cancer，1997，74：316-321.

［11］Ellenrieder V，AIber B，Lacher U，et al.Role of MT-MMPs and MMP-2 in pancreatic cancer progression［J］.Int J Cancer，2000，85:14-20.

［12］Nakamura H，Ueno H，Yamashita K，et al.Enhanced production and activation of progeIatinase A mediated by membrane-type1 matrix metalloproteinase in human papillary thyroid carcinomas［J］.Cancer Res，1999，59：463-467.

［13］Sakakibara M，Koizumi S，Saikawa Y，et aI.Membranetype matrix metalloproleinase-1 expression and activation of gelatinise A as prognostic markers in advanced pediatric neuroblastoma［J］.Cancer，1 999，85:231-239.

［14］Makoto N，Junseo O，Rei T，et al.RECK:A novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellular matrix remodeling［J］.Cancer Metastasis Res，2003，22（23）：167-175.

［15］張杰，顏虹.RECK基因在惡性腫瘤浸潤和轉移中作用的研究進展［J］.陜西醫(yī)學雜志，2011，6（40）:732-734.

［16］Akira O，Tomoko M，Kazuhiro M，et al.RECK Forms Cowbell-shaped Dimers and Inhibits Matrix Metalloproteinase-catalyzed Cleavage of Fibronectin［J］. Bio Chem，2009，284（6）:3461-3469.

［17］Norihiro T，Mitsuhiro T，Yasuhiro H，et al.Lowexpression of reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs（RECK）indicates a shorte survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung［J］.Lung Cancer，2007，58:376-383.

［18］Taku T，Michiyoshi H，Mitsuo N，et al.The membrane anchored matrix metalloproteinase regulator RECK in combination with MMP-9 serves as an informative prognostic indicator for colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10（8）：5572-5579.

Expression of RECK Gene and Matrix Metalloproteinase-2，Matrix Metalloproteinase-14 in the Primary Plemorphic Adenoma（PA），Recurrent PA and Malignant PA

Ayinuer Aibibula，YIN Xiao-peng，GONG Zhong-cheng，LIU Hui，LING Bin，Keremu Abass，HU Lu-lu，NING Xiao-ting，YANG Meng，CHEN Qing-li，LIN Zhao-quan
（Department of Oral&Maxillofacial Oncology Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Stomatology College of Xinjiang Medical University，Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the expression and significance of RECK gene and Matrix Metalloproteinase-2（MMP-2），Matrix Metalloproteinase-14（MMP-14）in the primary plemorphic adenoma（PA），recurrent PA and malignant PA.Methods Fifty samples including 36 primary PA，7 recurrent PA，7 malignant PA and 10 normal parotid glands as control were examined immunohistocheemically.Among the 10 PA samples，there were all samples originated from parotid gland.RECK gene，MMP-2 and MMP-14 were decected immunohistochemically and semi-quantitively in these samples.All date were analyzed through SPSS 21.0 software.Results MMP-2 has significant difference in normal group and recurrent group（P＜0.05），the difference was statistically significant in normal group and the malignant group（P＜0.05）；the difference was statistically significant in primary group and recurrent group（P＜0.05）；the difference was statistically significant in primary group and the malignant group（P＜0.05）.The expression of RECK and MMP-2 and MMP-14 were negative correlation，respectively，in normal parotid gland，primaryPA，recurrent PA and maligant PA（r=-0.887，P＜0.05；r=0.798，P＜0.05）.Conclusion Clinically，in the tissue of the salivary glands，PA will relapse.When examined both RECK and MMP-2 have significant meaning.Through this examination，tumor aggressiveness and prognosis can be indicated.

Salivary glands；Pleomorphic adenoma；MMP-2；MMP-14；RECK；Immunohistochemisty

R739.8

A

1008-6455（2015）05-0040-07

2015-01-26

2015-03-23

編輯/張惠娟

新疆醫(yī)科大學第一附醫(yī)院自然科學青年基金（編號：2013ZRQN36），名稱：RECK基因與MMPs在涎腺多形性腺瘤復發(fā)及惡變中的表達及其意義

龔忠誠，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科，新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，郵編：830054；E-mail:gump0904@aliyun.com