蛋白質(zhì)組學(xué)在糖尿病中的應(yīng)用

曹凱淇

·綜述·

蛋白質(zhì)組學(xué)在糖尿病中的應(yīng)用

曹凱淇

糖尿病是人類慢性病之一，是目前世界范圍內(nèi)繼腫瘤、心血管疾病后的第三位嚴(yán)重危害人類健康的非傳染性疾病。糖尿病長期的代謝紊亂常常引起多個系統(tǒng)的損傷，可導(dǎo)致心、眼、腎、神經(jīng)和血管等器官組織的慢性進(jìn)行性改變或者功能減退及衰竭。及時、早期診斷治療糖尿病可以有效地控制血糖水平及防止并發(fā)癥的發(fā)生。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，分子生物的研究領(lǐng)域已轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)是全球評價(jià)蛋白表達(dá)的有力工具，尚未廣泛地用于糖尿病的研究。本文對照糖尿病和正常組織間的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有利于糖尿病及其并發(fā)癥的新的研究靶點(diǎn)，對糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)進(jìn)行了概括介紹。

糖尿?。坏鞍踪|(zhì)組學(xué)；應(yīng)用

1 前言

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，WTO認(rèn)為到2025年世界上約有3.3億糖尿病患者。目前我國已取代印度，成為全球糖尿病第一大國，并且仍以每年超過120萬人的速度增加，已成為糖尿病發(fā)病的“重災(zāi)區(qū)”。患者主要以2型糖尿病為主，占90%～95%[1]。雖然對糖尿病的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)做了很大的努力，但糖尿病及其并發(fā)癥背后的發(fā)病機(jī)制仍未明確。自從研究者們通過識別和量化糖尿病患者及對照組的組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，蛋白質(zhì)組學(xué)越來越受到歡迎?，F(xiàn)今，蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展為糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)現(xiàn)提供了有力的條件，可以有效的篩選和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，對糖尿病及其并發(fā)癥的鑒定和治療學(xué)的新方向發(fā)揮了有效的作用。本文概述了近年來對糖尿病及其并發(fā)癥的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法，找到糖尿病相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展

蛋白質(zhì)組(proteome)一詞，來源于蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個詞的雜合。這一概念是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Willions等人于1994年提出，是指一種細(xì)胞、組織或有機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，對組織、細(xì)胞的整體蛋白進(jìn)行檢測。包括蛋白質(zhì)表達(dá)水平、氨基酸序列、翻譯后加工和蛋白質(zhì)間的相互作用，在蛋白質(zhì)水平上了解細(xì)胞的各項(xiàng)功能、各種生理、生化過程及疾病的生理過程等?？梢?，蛋白質(zhì)組學(xué)就是以細(xì)胞或組織不同時間、環(huán)境的所有蛋白質(zhì)為研究對象，從整體上研究蛋白質(zhì)的種類、相互作用以及功能結(jié)構(gòu)的學(xué)問。

蛋白質(zhì)組學(xué)大致可以分為基于膠的差異分析技術(shù)及非膠差異分析技術(shù)，前者主要包括雙向凝膠電泳、熒光雙向差異凝膠電泳等，后者包括多維液相色譜、穩(wěn)定同位素特征標(biāo)簽生物質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和表面增強(qiáng)激光解析電離分析時間質(zhì)譜技術(shù)等[2]。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對糖尿病的應(yīng)用

隨著我國人口老齡化的加劇和人們生活方式的改變，2型糖尿病的患病率不斷升高，因其他疾病必須接受手術(shù)治療的糖尿病患者也日漸增多。

Cabre等[3]在研究糖尿病患者中Apo多形態(tài)與高血脂的關(guān)聯(lián)中發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者中TC雜合子血漿Apo A5水平及富含TG的脂蛋白濃度是TT純合子的兩倍，提示2型糖尿病患者Apo A5-1131T＞C基因型多態(tài)性影響Apo A5的功能。

研究表明胰腺癌也許會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。Wang等[4]旨在識別這些有可能與胰腺癌誘導(dǎo)糖尿病的相關(guān)蛋白質(zhì)。他們利用相對和絕對定量(i-TRAQ)加上二維液體色譜，用質(zhì)譜法比較胰腺癌患者組織中與糖尿病相關(guān)或無關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，及相鄰非腫瘤組織中有無糖尿病相關(guān)的蛋白。S100鈣結(jié)合蛋白129和乙醛脫氫酶2家族被選擇用來驗(yàn)證蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化結(jié)果。對胰腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的識別，以便更好理解和進(jìn)一步探索胰腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的病因和病機(jī)。

Kim[5]團(tuán)隊(duì)專注于2型糖尿病的胰島素抵抗的肝臟、肌肉和脂肪組織的結(jié)果。他們使用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的方法，以確定新的肝細(xì)胞相關(guān)的膜蛋白、肝臟胰島素抵抗、脂肪肝及2型糖尿病的發(fā)展。使用FT-ICR-MS技術(shù)，確定了在正常和2型糖尿病db/db小鼠肝臟中95種顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白主要參與能量代謝途徑，分子運(yùn)輸和蜂窩信號，而這些中的大多數(shù)以前并沒有用于糖尿病的研究中。生物信息學(xué)分析顯示，16個蛋白質(zhì)可能與肝臟中胰島素信號的調(diào)節(jié)有關(guān)。他們也許可以作為有效的診斷標(biāo)志物和(或)治療方法。

Zhang等[6]使用全球液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)蛋白分析技術(shù)，確定了24種血清蛋白在1型糖尿病患者和健康對照組之間存在著差異。從功能上，這些蛋白質(zhì)代表先天免疫反應(yīng)，激活補(bǔ)體級聯(lián)，炎癥反應(yīng)和凝血等。16肽具有很好的鑒別力，血小板堿性蛋白肽和C1抑制劑具有100%敏感性和100%特異性。這些生物標(biāo)志物可以將1型糖尿病與健康對照組和2型糖尿病區(qū)分開。充分顯示了先天免疫反應(yīng)與1型糖尿病的發(fā)展存在某種關(guān)聯(lián)。

1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其特征是在胰島β細(xì)胞中存在自身抗體。然而，高達(dá)2%～5%患有1型糖尿病患者中已知抗體陰性，這表明1型糖尿病患者中自身抗原面板并不完整。為了確定新的1型糖尿病自身抗原，Massa O等[7]采用熒光免疫和2-DE技術(shù)對臨床診斷為1型糖尿病且自身抗體陰性的受試者血清進(jìn)行鑒別，其中有111種蛋白質(zhì)質(zhì)譜被識別。在目前的工作中，他們精心選擇了少數(shù)自身免疫抗體和基因均陰性的患者，在胰島β細(xì)胞提取以確定新的候選1型糖尿病自身抗體。

為了在尿液中發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的分子特征，證明其與1型糖尿病的發(fā)展過程有關(guān)，Soggiu A等[8]對1型糖尿病患者和正常對照組微量白蛋白進(jìn)行對比分析，利用高分辨率二維凝膠電泳分離和MALDI-TOF-MS、LC-MS蛋白質(zhì)分離技術(shù)，對1型糖尿病患者和對照組尿液進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者和對照組間幾種蛋白質(zhì)存在表達(dá)差異，特別是5種蛋白下調(diào)和4種蛋白上調(diào)。低表達(dá)的蛋白分別為Tamm-Horsfall尿糖蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白E、α2-巰基蛋白酶抑制劑、人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59；同時較高表達(dá)的有α1微球蛋白、鋅α2糖蛋白、α1β糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白等4種。這些差異始終存在于1型糖尿病患者與健康對照組中。此外，這些蛋白還與糖化血紅蛋白有關(guān)。這項(xiàng)研究提供了新的見解：尿蛋白可作為1型糖尿病蛋白質(zhì)分子機(jī)制的潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在糖尿病并發(fā)癥中的應(yīng)用

糖尿病可影響心臟、血管、腎、眼等多系統(tǒng)組織，伴隨或引發(fā)多種急性或慢性并發(fā)癥，損害健康甚至危害到生命。如：DKA、糖尿病非酮癥性高滲綜合征、乳酸性酸中毒等急性并發(fā)癥，以及足病、腎病(腎衰竭、尿毒癥)、眼病、腦病、心臟病、皮膚病等慢性并發(fā)癥。英國前瞻性糖尿病研究表明，新診斷的2型糖尿病中約一半已有血管并發(fā)癥[9]。

蛋白質(zhì)組學(xué)方法能夠更好地了解糖尿病并發(fā)癥的病理生理。鑒于此，Bhonsle HS等[10]在糖尿病患者血漿樣本的差異蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫印跡分析相結(jié)合的研究，雙向凝膠電泳和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用顯示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括纖維蛋白原，結(jié)合珠蛋白的上調(diào)和下調(diào)的維生素D結(jié)合蛋白、α1抗胰蛋白酶、甲狀腺素運(yùn)載蛋白和載脂蛋白A，在糖尿病和健康對照組患者血清中表達(dá)有差異。在這些蛋白中，Apo A1下調(diào)在糖尿病控制不佳組中表現(xiàn)尤為突出。因此，Apo A1的下調(diào)可作為糖尿病并發(fā)癥早期預(yù)測指標(biāo)。

4.1 糖尿病腎臟疾病 糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管慢性并發(fā)癥，發(fā)病率逐年增高，已成為危害人類健康的重大疾病。在歐美國家，糖尿病腎病也是終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)的最常見病因，約占全部ESRD病例的44%。DKD起病隱匿，臨床上早期診斷糖尿病腎臟疾病存在較大困難。腎穿刺活檢術(shù)創(chuàng)傷大，并發(fā)癥多，且費(fèi)用較高，患者難以承受，而尿液中富含腎臟病變信息，取材簡單，無創(chuàng)傷。姜洪娟[11]利用雙向凝膠電泳和熒光差異凝膠電泳技術(shù)對2型糖尿病尿液標(biāo)本進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。篩選糖尿病腎臟疾病患者尿液中的差異表達(dá)蛋白，通過2-DE和2D-DIGE/MS兩種蛋白質(zhì)組學(xué)方法，均被鑒定出來的6種蛋白分別是：上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、血清白蛋白、鋅α2糖蛋白、α1酸性糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、尿調(diào)節(jié)素。這些差異蛋白的識別為糖尿病腎病的早期診斷研究提供了候選標(biāo)志物，有助于DKD早期診斷和發(fā)病機(jī)制的深入探索。

Zurbig等[12]認(rèn)為尿蛋白組分析技術(shù)可以作為預(yù)測糖尿病腎病的一種工具，毛細(xì)血管電泳耦合質(zhì)譜用于分析尿中低分子量蛋白質(zhì)組。收集1型和2型糖尿病患者尿液標(biāo)本，這些標(biāo)本事前用產(chǎn)生慢性腎臟疾病的生物標(biāo)志物進(jìn)行分類，進(jìn)行長達(dá)5年的尿白蛋白追蹤檢測。對每個尿慢性腎臟疾病生物標(biāo)志物進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并描述它對于將來診斷糖尿病腎病的可能性。與3～5年之前的數(shù)據(jù)相比，膠原蛋白碎片顯著改變。在白蛋白開始增加之前，膠原蛋白碎片就開始減少了。通過檢測相關(guān)膠原蛋白碎片，尿蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在早期階段非侵入性評估糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)。

Wu等[13]目前是利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對2型糖尿病患者的尿蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，去尋找新型的潛在生物標(biāo)志物來對2型糖尿病腎病進(jìn)行早期診斷。所用方法是采集95例分別來自2型糖尿病患者及健康對照組的尿微量白蛋白進(jìn)行SELDI-TOF-MS技術(shù)分析。結(jié)合生物信息學(xué)工具，利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)獲得超過300個從1～80 kDa的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)果。其中40個m/z從2 008.78～79 176.55 Da在2型糖尿病與對照組間存在顯著差別。2 797.03、4 545.77、4 984.03和9 083.71 Da的蛋白質(zhì)被選擇作為2型糖尿病患者潛在生物標(biāo)志物，其敏感性達(dá)88%，特異性達(dá)97.6%。結(jié)論：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可以幫助發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物并可提供一種新的非侵入性工具用于早期診斷2型糖尿病。

Zhang等[14]旨在利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)識別和分析參與糖尿病腎病發(fā)展的新的蛋白質(zhì)。經(jīng)過分析表明，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的合成酶2(HMGCS2)─生酮作用的關(guān)鍵酶，在2型糖尿病db/db小鼠腎臟增加了4倍。免疫組化、免疫熒光、實(shí)時PCR研究進(jìn)一步證明，HMGCS2在db/db小鼠在腎小球中高度表達(dá)，對照組中低度表達(dá)。總之，這些研究表明，糖尿病患者腎臟表現(xiàn)出多余的酮活動增加與HMGCS2表達(dá)有關(guān)，糖尿病腎病中酮體生成的增加可能是其發(fā)病的一種新的機(jī)制。

4.2 糖尿病心血管疾病 糖尿病患者常發(fā)展為高血壓和動脈粥樣硬化導(dǎo)致心血管疾病。然而有些糖尿病患者無高血壓和冠狀動脈疾病，而發(fā)展為心力衰竭的過程稱為糖尿病性心肌病。根皮疳是一種有效的治療糖尿病的氧化劑，但對其糖尿病心肌病的心臟保護(hù)作用知之甚少。Cai等[15]在這項(xiàng)研究中，調(diào)查了db/db小鼠糖尿病心肌病的根皮疳保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)，根皮疳能顯著減少體重增加和血清空腹血糖水平(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)，形態(tài)學(xué)觀察表明，經(jīng)根皮疳治療后正常心臟結(jié)構(gòu)能夠更好地保護(hù)。使用相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)，可以確定，根皮疳可能防止糖尿病心肌病的發(fā)展。根皮疳用于治療糖尿病性心肌病可能是一種新的治療方法。

Ares等[16]對于糖尿病和高血壓對心臟的潛在協(xié)同作用表現(xiàn)出了極大的興趣，尤其是對蛋白質(zhì)的病理表型和相關(guān)的肥大反應(yīng)。他們培養(yǎng)正常和自發(fā)性高血壓小鼠，22周后對1型糖尿病、自發(fā)性高血壓(SHR)、自發(fā)性高血壓/1型糖尿病小鼠等使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，長期1型糖尿病、自發(fā)性高血壓、自發(fā)性高血壓/1型糖尿病小鼠表現(xiàn)出24.53和53改變蛋白分別在不同心肌。1型糖尿病心肌表明細(xì)胞凋亡和細(xì)胞復(fù)雜蛋白的過度表達(dá)，抗凋亡和線粒體代謝酶下調(diào)。雖然關(guān)鍵的β-氧化酶并沒有激活1型糖尿病和高血壓性心肌病，但過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)可能激活其他的反應(yīng)。在這方面，PPARα刺激減少了如膜聯(lián)蛋白-Ⅴ在高糖和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的肥大和肥厚因素。因此，PPARα的激活能夠反應(yīng)高血壓、糖尿病心肌病的代謝轉(zhuǎn)移，凋亡增生性代償性反應(yīng)。

Essop等[17]認(rèn)為線粒體功能受損，可能會導(dǎo)致2型糖尿病/胰島素抵抗患者細(xì)胞收縮功能障礙。因此，他們致力于確定肥胖的2型糖尿病小鼠模型中線粒體蛋白質(zhì)組的改變。利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜及Mascot軟件等得出結(jié)論：細(xì)胞色素C還原酶、核心蛋白1和電子轉(zhuǎn)移核黃素蛋白亞型α-肽水平發(fā)生改變。此外，還發(fā)現(xiàn)肥胖受試者心臟的收縮蛋白協(xié)調(diào)下降，即α-平滑肌肌動蛋白、α-心肌肌動蛋白、肌球蛋白重鏈α和肌球蛋白結(jié)合蛋白C。結(jié)論：心臟收縮蛋白的下調(diào)可能與糖尿病小鼠的心臟收縮功能障礙有關(guān)。

4.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變 Takahashi等[18]應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組分析使用iTRAQ技術(shù)在2型糖尿病小鼠的相關(guān)血清蛋白中發(fā)現(xiàn)，人類的同系物SERPINA3增加了視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性。這也許是糖尿病和(或)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制。有了這些鑒別蛋白，可以提供更有價(jià)值的線索去理解糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。

5 妊娠期糖尿病

妊娠合并糖尿病作為產(chǎn)科常見孕期合并癥之一，是指妊娠期出現(xiàn)的糖尿病異常。國外報(bào)道顯示，妊娠合并糖尿病發(fā)病率高達(dá)5%，而我國篩查檢出率只接近3%[19-20]。妊娠合并糖尿病對于母嬰均有嚴(yán)重不利的影響，其臨床治療越來越受到國際醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[21]。臨床報(bào)道顯示妊娠合并糖尿病產(chǎn)婦母嬰并發(fā)癥發(fā)病率及病死率明顯高于正常健康產(chǎn)婦，特別是妊娠期未早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行有效血糖控制者[22]。圍產(chǎn)期死亡率極高。有報(bào)道提示血糖水平與早期子癇發(fā)生率呈正相關(guān)[23]。故做好臨床妊娠合并糖尿病篩查，早期診斷、早期治療，有效控制血糖水平，對于改善母嬰預(yù)后具有重要作用。

Kim等[24]設(shè)計(jì)研究的目的是確定蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物進(jìn)以預(yù)測妊娠期糖尿病(GDM)的后期發(fā)展。運(yùn)用表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時間(SELDI-TOF-MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，得到結(jié)論如下：三個峰(9 122、9 412、9 701 Da)增加，被認(rèn)為與載脂蛋白CⅢ亞型(17 105 Da峰值極度下降)相匹配。ELISA實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，GDM的婦女載脂蛋白CⅢ確實(shí)比對照組有著顯著較高水平。他們的數(shù)據(jù)表明，妊娠期糖尿病婦女母體內(nèi)在16～20周時已經(jīng)存在生物標(biāo)志物。

6 前景

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是近年興起的研究各方面疾病的最前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)之一，為臨床糖尿病的研究提供了強(qiáng)有力的工具，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[25]。但是相對基因組研究，它還處于初級階段，目前還難以實(shí)現(xiàn)鑒定細(xì)胞和組織的每一個蛋白質(zhì)，如極酸、極堿、低豐度、難溶性蛋白質(zhì)以及低拷貝數(shù)蛋白等，還未找到最佳的方法來分離；小分子蛋白檢測困難；重復(fù)性也還不夠；對于糖尿病與正常組織或細(xì)胞的差異分析，也往往缺少適合的正常組織和細(xì)胞作為對照。

總之，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，樣本處理技術(shù)、蛋白質(zhì)組分離技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)及生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)例臨床應(yīng)用越來越近，必將在糖尿病及其并發(fā)癥等疾病方面發(fā)揮巨大作用。

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Diabetes is a chronic disease in humans which is the third serious non-infectious disease to human health in a worldwide scope following cancer and cardiovascular disease.Long-term metabolic disorders of diabetes often causes damage to multiple systems leading to chronic progressive change or dysfunction and failure of heart，eyes，kidneys，nerves and blood vessels.Timely and early diagnosis and treatment of diabetes can effectively control blood sugar levels and prevent complications.With the completion of human genome project，the research field of molecular biology has transferred to the proteomics research.Proteomics is a powerful tool for evaluation of protein expression in the world，which has not yet been widely used in the study of diabetes.Through the comparison of protein expression spectra between diabetes and normal tissue，in this paper it finds new study target spot beneficial to diabetes and its complications，and it also summarizes the proteomics research technique about the pathogenesis of diabetes and its complications.

Diabetes；Proteomics；Application

2014-05-20)

1005-619X(2015)02-0126-04

10.13517/j.cnki.ccm.2015.02.006

116023沈陽軍區(qū)大連療養(yǎng)院小平島療養(yǎng)區(qū)