染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay，CHIP)是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

ChIP具體操作流程：

第一天：

一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

1.取出細(xì)胞，加入甲醛，使得甲醛的終濃度為1%。

2.37攝氏度孵育10 min。

3.終止交聯(lián)。

4.吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。

5.細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中。預(yù)冷后離心收集細(xì)胞。

6.倒去上清。

7.超聲破碎。

二、除雜及抗體哺育

8.超聲破碎結(jié)束后，離心去除不溶物質(zhì)。

9.在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 ul ChIP Dilution Buffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1 h。

10.1 h后，在4攝氏度靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。

11.取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。

三、檢驗(yàn)超聲破碎的效果

取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65℃處理2 h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測(cè)超聲效果。

第二天：

免疫復(fù)合物的沉淀及清洗

12.孵育過(guò)夜后，每管中加入60 ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)2 h。

13.4℃靜置10 min后，離心除去上清。

14.清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉(zhuǎn)10 min，4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。

15.清洗完畢后，開(kāi)始洗脫。

16.解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2 M)?；靹?，65℃解交聯(lián)過(guò)夜。

第三天：

一、DNA樣品的回收

17.解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 ul RNaseA(MBI)，37℃孵育1 h。

18.每管加入10 ul 0.5M EDTA，20 ul 1M Tris.HCl(PH6.5)，2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。

19.DNA片段的回收-omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100 ul ddH2O。

二、PCR分析

·消息·