體外震波對內(nèi)皮細胞影響的研究進展*

左偉高福強孫偉**

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所；2.中日友好醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科骨壞死與關(guān)節(jié)保留重建中心，北京100029）

體外震波對內(nèi)皮細胞影響的研究進展*

左偉1高福強2孫偉2**

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所；2.中日友好醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科骨壞死與關(guān)節(jié)保留重建中心，北京100029）

體外震波（extracorporealshock wave，ESW）是一種特殊形式的脈沖聲波。當(dāng)ESW以聲能的形式在皮膚、肌肉、脂肪、韌帶、肌腱及骨骼等具有不同聲抗特性的介質(zhì)界面?zhèn)鞑r，產(chǎn)生不同的機械作用力。細胞可以感受各種力學(xué)刺激并將其轉(zhuǎn)化為各種生物信號，從而影響細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等生理功能[1]。ESW在臨床已廣泛應(yīng)用于治療足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩關(guān)節(jié)鈣化性肌腱炎、骨不連、股骨頭缺血性壞死等疾病，并且臨床和動物實驗證實ESW具有抗炎、成血管、成骨、促進創(chuàng)面愈合等作用，然而ESW作用的具體機制還未完全闡明。

內(nèi)皮細胞襯貼于血管的腔面，持續(xù)受到血液流動產(chǎn)生的各種力學(xué)刺激。內(nèi)皮細胞能夠感受各種力學(xué)刺激并將其轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生化信號，調(diào)節(jié)控制細胞生理功能。與此同時也和許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。因此機械力學(xué)作為外部信號如何影響內(nèi)皮細胞生理功能的改變及機械力學(xué)導(dǎo)致的細胞內(nèi)生化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制成為近年的研究熱點。機械力學(xué)刺激作用于內(nèi)皮細胞通過激活力學(xué)感受器、信號傳導(dǎo)通路、基因和蛋白的表達，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生理功能。當(dāng)內(nèi)皮細胞受到具有固定方向的力學(xué)刺激（例如：動脈搏動性剪切力和單軸向拉伸力）時，只引起短暫的促炎癥和促增殖通路分子信號的激活。當(dāng)固定方向的機械刺激持續(xù)存在時，這些信號的傳導(dǎo)都受到抑制。當(dāng)受到?jīng)]有固定方向的機械刺激（例如：血管分支、結(jié)構(gòu)異常部位的湍流和相對無向拉伸力）時，將導(dǎo)致促炎癥和促增殖通路分子信號的持續(xù)激活。因此內(nèi)皮細胞對機械力學(xué)刺激的功能性反應(yīng)，一方面構(gòu)成其對生理功能控制調(diào)節(jié)的一個關(guān)鍵因素，同時參與許多血管相關(guān)疾病的發(fā)病因素[3-6]。

1 內(nèi)皮細胞力學(xué)傳導(dǎo)機制

研究表明細胞質(zhì)膜上的胞質(zhì)膜微囊，作為質(zhì)膜上平臺介導(dǎo)多種細胞功能，包括機械力學(xué)信號的傳導(dǎo)[7]、血液流動和壓力的改變導(dǎo)致胞質(zhì)微囊部位蛋白磷酸化水平發(fā)生改變[8]。微囊蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是微囊主要組成成分，Cav-1缺失的小鼠對機械刺激的生理反應(yīng)缺失[9]。內(nèi)皮細胞膜蛋白成分如離子通道、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2（vascular endothelial grow th factor receptor-2，VEGFR-2）、G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）能感受并且傳導(dǎo)機械刺激。在剪切力作用下可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞膜K+通道的開放[10]，并且導(dǎo)致舒血管物質(zhì)的釋放和基因的表達。同時研究表明剪切力導(dǎo)致鈣瞬變[11]，而拉伸力導(dǎo)致內(nèi)皮細胞非選擇性陽離子通道的開放[12]。值得注意的是，機械刺激誘導(dǎo)的其他分子信號能夠間接活化離子通道。研究表明：在機械刺激開始的1 s，能夠激活內(nèi)皮細胞特定G蛋白偶聯(lián)受體，在機械刺激作用下通過GPCRs直接或間接活化G蛋白，進而引發(fā)細胞內(nèi)磷酸化過程。細胞膜表面原纖毛也是內(nèi)皮細胞的力學(xué)感受器之一，細胞實驗證明，具有纖毛結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細胞比不具有纖毛結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細胞對剪切力反應(yīng)更加強烈[13]。缺乏原纖毛的內(nèi)皮細胞不能將機械刺激轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞內(nèi)Ca2+和NO信號。

內(nèi)皮細胞膜表面糖萼不僅作為一個屏障來限制分子和白細胞黏附到內(nèi)皮表面，而且與內(nèi)皮細胞力學(xué)傳導(dǎo)相關(guān)。流體刺激調(diào)節(jié)糖萼的產(chǎn)生與分布[14]。當(dāng)在剪切作用24 h后，糖萼的組成成分，如硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、磷脂酰肌醇聚糖等，表達增加[15]。當(dāng)用乙酰肝素酶去除糖萼后，流體刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞反應(yīng)則顯著下降[16]。

整合素是內(nèi)皮細胞重要的力學(xué)感受器。在剪切力作用下，整合素與細胞外基質(zhì)配體在黏附斑處的結(jié)合是信號通路傳導(dǎo)的起始，并導(dǎo)致血管的舒張和血壓的調(diào)節(jié)[17]。黏附斑激酶是黏著斑重要組成部分，并且是細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)者。機械性牽張力能快速

增加局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的磷酸化。研究表明FAK參與循環(huán)牽張力和剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖、形態(tài)重構(gòu)和炎性反應(yīng)過程[18]。

2 ESW對內(nèi)皮細胞作用機制基礎(chǔ)研究

2..1 ESW ESW作用于細胞參數(shù)選擇

根據(jù)震波產(chǎn)生的方式不同，可分為液電式、電磁式、電壓式，按能量高低分為低能量ESW（0.1～0.001m J/mm2）和高能量ESW（＞0.2m J/mm2）。在應(yīng)用ESW作用于體外培養(yǎng)細胞時通常采用低能量級，但作用的確切參數(shù)目前尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

Ha等[20]使用能流密度為0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）時細胞形態(tài)、凋亡率、增殖率與對照組無明顯差別。能流密度為0.09 m J/mm2作用1000次時，細胞死亡率很高，當(dāng)達到0.016m J/mm21000次時，幾乎所有細胞與培養(yǎng)皿底部分離并死亡。Takahiro等[19]將HUVECs分為四組，每組分別使用不同能流密度的ESW，分別為0.02、0.09、0.18和0.35 m J/mm2，每組各作用500次后，在相同條件下培養(yǎng)24 h，檢測血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial grow th factor，VEGF）和fms樣酪氨酸激酶（fins-like tyrosine kinase-1，F(xiàn)LT-1）mRNA的表達情況。結(jié)果顯示：在能流密度為0.09m J/mm2的ESW作用500次時，VEGF和FLT-1的mRNA表達為最高水平。

Sansone等[21]將人微血管內(nèi)皮細胞（humanm icrovascular endothelial cell，HMECs）分為兩組，分別使用0.01和0.02m J/mm2的ESW，相同能流密度組按作用次數(shù)200和800劃分小組。結(jié)果顯示：0.01m J/mm2的ESW作用200次時ESW促血管生成作用最強。

Zhang等[22]在研究ESW作用于細胞最佳參數(shù)選擇的實驗中，將內(nèi)皮組細胞分為5組。每組分別使用不同能流密度的ESW，同時每個大組又根據(jù)接受ESW作用次數(shù)的不同分為4小組，48 h后檢測血管生成因子、凋亡因子、炎癥介質(zhì)、趨化因子的表達水平。結(jié)果顯示：當(dāng)細胞受到能流密度為0.04～0.13m J/mm2的ESW刺激作用時，血管生成因子的表達增加，而細胞的凋亡因子表達下降。當(dāng)作用于細胞的ESW能流密度為0.16m J/mm2時，血管生成因子表達下降，細胞凋亡因子表達增加。當(dāng)作用能量相同而次數(shù)不同時，表現(xiàn)出的作用趨勢類似。作用次數(shù)相對少時，細胞因子的表達增加，凋亡因子的表達減少。作用次數(shù)多時，抑制細胞因子的表達且導(dǎo)致細胞的凋亡。由此推斷：ESW作用于體外培養(yǎng)細胞最適宜參數(shù)為0.1～0.13m J/mm2，作用次數(shù)為200～300次。

2.2 ESW ESW促內(nèi)皮細胞血管形成作用

在臨床和活體實驗中應(yīng)用ESW表明，ESW具有促進血管形成作用。Zimpfer等[23]用ESW刺激小鼠心肌梗死模型心外膜，分別在第六周和第十四周通過組織學(xué)定量檢測法顯示，ESW能增加梗死心肌模型微血管密度。Stojadinovic等[24]用ESW作用于小鼠缺血皮膚模型，6 h后檢測到血管生成因子的表達增加，并且在第4天和第7天之后觀察到血管形成增加。Oi等[25]將ESW作用于缺血骨骼肌，28 d后觀察到毛細血管密度的增加。根據(jù)上述描述，ESW作用于組織細胞促進血管形成的可能機制為ESW通過促進VEGF和一氧化氮（nitric oxide，NO）的表達增加促進血管形成。然而在Sansone等[21]用能流密度為0.01m J/mm2ESW 200次作用于3D基質(zhì)培養(yǎng)模型中的HMECs，12 h后觀察到毛細血管連接的顯著增加，但在作用早期3 h并未檢測到血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達增加，在作用后3 h檢測發(fā)現(xiàn)，凋亡過程相關(guān)基因（BAX、BCL2LI、GADD45A、PRKCA）、細胞周期相關(guān)基因（CDKN2C、CEBPB、HK2、IRF1、PRKCA）、細胞黏附分子（ICAM-l）、癌基因（JUN、WNT1）表達下降。Nishida等[19]使用0.09m J/mm2的ESW 500次作用于HUVECs，24 h后觀察到VEGF和FLT-1表達的顯著增加。Zhang等[22]用0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs，發(fā)現(xiàn)ESW能激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、eNOS和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk1/2）的磷酸化，并進一步證實ESW作用于HUVECs通過激活由VEGF-2、血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（plateletendothelial cell adhesionmolecule-1，PECAM-1）和VE-鈣黏著蛋白組成的機械感覺傳導(dǎo)復(fù)合體，使PI3K、Akt、eNOS和Erk1/2發(fā)生磷酸化，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子Akt、eNOS、KLF2、KLF4、MTI-MMP、MMP10、NP4A1的表達增加導(dǎo)致成血管效應(yīng)。

2.3 ESW ESW作用于內(nèi)皮細胞的抗炎癥反應(yīng)作用

ESW在臨床成功應(yīng)用于治療肌肉結(jié)締組織炎性疾病，例如足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩關(guān)節(jié)鈣化

性肌炎。ESW作用于機體產(chǎn)生抗炎作用的具體機制還未闡明，其可能機制為ESW促進細胞的NO生成增加。Mariotto等[26]用0.03m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs，30m in后檢測到eNOS活性增加，且用共焦顯微鏡和特殊的NO染色探針證實細胞內(nèi)NO生成增加，并且當(dāng)HUVECs與eNOS抑制劑（LNAME）共同培養(yǎng)時，NO的生成受到顯著抑制，并通過使用ESW作用于脂多糖（LPS）或干擾素（IFN-γ）與HUVECs共同培養(yǎng)制作的細胞炎癥反應(yīng)模型，證實eNOS的激活導(dǎo)致NO生成的增加，抑制了核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factorκgene binding，NF-κB）的活化，由此抑制了炎癥因子基因的表達，產(chǎn)生抗炎作用。

最近有文獻報道，ESW的抗炎作用可能與模式識別受體（toll-like receptor 3，TLR3）的活化有關(guān)。TLR3是固有免疫系統(tǒng)的組成部分，參與識別來自病毒的雙鏈RNA和DNA片段，并且能夠探測到鄰近細胞釋放的細胞溶質(zhì)RNA。Holfeld等[27]使用0.08m J/mm2的ESW 250次作用于HUVECs，后分別在2 h、4 h、6 h檢測TLR3、CYP-B、CYP-A、IL-6、IL-10和VCAM的表達情況，推測ESW作用于HUVECs產(chǎn)生抗炎作用的可能機制為TLR3活化導(dǎo)致的炎癥調(diào)節(jié)三階段反應(yīng)。第一階段由IL-6介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)階段。第二階段IL-10表達的逐漸增加并抑制IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)階段。第三階段IL-10表達的持續(xù)增加，IL-6表達下降，炎癥反應(yīng)受到抑制階段。

2.4 ESW ESW對內(nèi)皮細胞的增殖、凋亡、遷移作用的影響

ESW在近些年來被用于治療骨不連和骨壞死，成為骨科領(lǐng)域一個新興的研究熱點，最近又被用于治療缺血性心肌疾病和下肢缺血性疾病，以促進局部組織血管新生。ESW促進組織血管再生的作用機制還未完全闡明。ESW作用于內(nèi)皮細胞影響細胞的增殖、凋亡、遷移以至進一步影響血管的再生。Ma等[29]使用低能量體外震波（low-energy extracorporeal shock wave，LE-ESW）作用于小鼠，研究結(jié)果表明，LE-ESW通過激活內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶促進VEGF的表達增加，VEGF是參與血管化調(diào)控的主要生長因子，它可觸發(fā)一系列的修復(fù)反應(yīng)，能有效地促進血管內(nèi)皮細胞增殖及遷移，促進新血管的形成。Hayashi等[30]使用0.26 m J/mm2的ESW 2000次作用于股骨頭壞死動物模型，實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比實驗組VEGF在作用后第2、4、8、12周表達明顯增加，且在停止使用ESW作用后實驗組與對照組VEGF表達無明顯差別。與此同時，實驗組VEGF基因表達明顯高于對照組。Sansone等[21]使用ESW作用于HMECs發(fā)現(xiàn)ESW可抑制內(nèi)皮細胞的凋亡從而促進血管再生。然而在Ha等[20]的體外研究中使用0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs后檢測內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)ESW作用組與對照組無明顯差別，但ESW作用組內(nèi)皮細胞的遷移率顯著高于對照組，顯示ESW促進內(nèi)皮細胞的遷移。

3 結(jié)語

組織細胞的生存不僅受到復(fù)雜的生化環(huán)境的影響，而且面臨各種機械力學(xué)作用。機械力學(xué)刺激對細胞生理功能平衡的調(diào)節(jié)有重要作用，是組織生理平衡和某些疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[28]。內(nèi)皮細胞在體內(nèi)始終受到血液流體力學(xué)作用，機械力學(xué)作用對血管內(nèi)皮細胞的生理功能以及相關(guān)疾病的發(fā)病機制有著十分重要的影響。體外震波作為一種新型非侵入性治療方法，其在臨床應(yīng)用中的療效取得了廣泛的認(rèn)可，其產(chǎn)生作用的具體機制還未完全闡明。體外震波作為一種特殊形式的機械力學(xué)刺激對內(nèi)皮細胞的生理功能有重要影響。研究體外震波對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生作用的具體機制，對于某些與內(nèi)皮細胞功能紊亂相關(guān)疾病的治療有重要意義。

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2095-9958（2015）04-0 187-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.02-020

國家自然科學(xué)基金面上項目（項目編號：81372013）；中日友好醫(yī)院面上項目（項目編號：2013-MS-27）；中日友好醫(yī)院青年科技英才計劃（項目編號：2014-QNYC-A-06）

**通信作者：孫偉，E-mail:sun887@163.com