定量核磁共振波譜法同時測定中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的含量

禹珊+郭強勝+王會琳+高建平+許旭

摘 要 建立了定量核磁共振波譜法同時測定虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的方法。樣品用80%乙醇和丙酮兩次超聲提取凈化，再用定量核磁共振波譜法測定?？疾炝藰悠奉A處理和核磁共振實驗條件對測定結果的影響，選擇氘代二甲亞砜-重水（10∶1， V/V）為溶劑，用基準物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀標定的2，3，5-三碘苯甲酸為內(nèi)標，選擇脈沖延遲時間為5 s，采樣次數(shù)為32次。定量峰為6.388～6.391 （白藜蘆醇：H-2，6， d， 2H）和6.322～6.330 （虎杖苷：H-4， t， 1H）。結果表明，NMR測定的精密度均小于0.6%，線性相關系數(shù)（r）均大于0.999， 白藜蘆醇和虎杖苷的檢出限分別為0.23和0.24 g/L，定量限分別為0.69 和1.57 g/L，包括樣品提取過程的回收率分別為97.7%～103.5%（RSD=2.4%）和94.5%～99.2%（RSD=1.6%），顯示出定量核磁共振法在中藥定量時的可靠性。實際測定4種虎杖飲片及配方顆粒樣品中白藜蘆醇和虎杖苷含量分別為3.57～5.69 mg/g和12.73～24.07 mg/g。

關鍵詞 定量核磁共振; 虎杖; 白藜蘆醇; 虎杖苷

1 引 言

虎杖為蓼科植物虎杖（Poilgonum cuspidatum Sieb.et Zucc）的干燥根莖及根，主要功效為利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，具有抗菌抗病毒、擴張血管、抗腫瘤、調(diào)節(jié)代謝等藥理作用^[1]?；⒄茸鳛槌Ｓ弥兴幰咽杖胫袊幍?sup>[2]，不久也會被收入歐洲藥典^[3]?；⒄群写簏S素和大黃素甲醚等蒽醌類化合物、白藜蘆醇和虎杖苷（白藜蘆醇苷）等二苯乙烯類化合物、鞣質(zhì)和多糖等成分。其中，白藜蘆醇和虎杖苷是虎杖中兩種主要藥效成分^[1，2]（化學結構見圖1），這兩種成分測定主要以高效液相色譜^[2，4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用^[5]為主。

〖TP<06543.tif>，+25mm＼.90mm，Y#〗[TS（][HT5”SS] 〖ZK（〗圖1 白藜蘆醇和虎杖苷的結構式

Fig.1 Chemical structure of resveratrol and polydatin〖ZK）〗[HT5][TS）]

定量核磁共振波譜（Quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy， qNMR）方法簡單、快捷，實際樣品測定時可以不使用待測組分的對照品^[6]。已先后被美國藥典、英國藥典^[7]、歐洲藥典收錄，中國藥典2010版也已收錄^[8]。近幾年來，qNMR方法已被廣泛用于化學藥物[9～13]、中藥與植物提取物[14～19]、體液樣品^{[20，21]}、異構體^[22]、食品^{[23，24]}等的定量分析。

本研究在對虎杖樣品進行有效提取的基礎上，建立了qNMR定量測定其中白藜蘆醇和虎杖苷兩種藥效成分的方法，考察了實驗條件的影響，對所建立的方法進行了驗證， 并用于實際樣品分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500MHz核磁共振譜儀（德國Bruker公司）;M2P精密天平（精度0.001 mg， 德國Startorius公司）;AB204-N天平（精度0.1 mg，上海世義精密儀器有限公司）;PS-20超聲波清洗儀（東莞市潔康超聲設備公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

dDMSO（氘代二甲基亞砜， Dimethyl Sulphoxide-D6， 99.9% D）和D2O（重水，Deuterium Oxide， 99.9% D） （Cambridge Isotope Laboratories Inc.）;白藜蘆醇（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號ZL130705008YY）;虎杖苷（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號ZL20120907YY）;2，3，5-三碘苯甲酸（Aladdin公司，批號23527）;鄰苯二甲酸氫鉀（基準物質(zhì)，99.05%～100.05%，國藥集團上?；瘜W試劑公司，批號20091218） ;無水乙醇和丙酮（分析純，國藥集團化學試劑公司）。實驗用水為某品牌蒸餾水。

樣品1為虎杖中藥超微飲片（湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，規(guī)格：1.2 g/袋，批號130439）;樣品2為虎杖中藥配方顆粒（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：1 g/袋，批號1109001S）;樣品3為虎杖中藥配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 g/袋，批號1109081）;樣品4為虎杖中藥飲片 （中藥原產(chǎn)地：浙江，上海華浦中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號：XD13032601）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備

虎杖樣品研細，準確稱取粉末1 g，加入30 mL乙醇-水（4∶1， V/V）搖勻，室溫超聲30 min， 抽濾，濾液于55 ℃水浴旋干。稱重后稱取部分產(chǎn)物與20 mL丙酮混勻，超聲30 min，抽濾，殘渣重復丙酮提取一次，合并濾液，于40 ℃水浴上旋干得產(chǎn)物并稱重。稱取適量產(chǎn)物及內(nèi)標2，3，5-三碘苯甲酸于塑料離心管中，加入0.55 mL dDMSO-D2O（10∶1， V/V），混合，超聲2 min，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中待測。endprint

2.2.2 核磁共振定量 核磁共振（NMR）采集條件：脈沖序列zg30，脈沖寬度14.4μs。選擇延遲時間5s，掃描次數(shù)32次，測定樣品的NMR譜圖。積分時，先將NMR譜圖基線調(diào)平，選定峰積分區(qū)間，每個峰積分3～5次，相對標準偏差（RSD）<1%時取平均值。用中國藥典2010版中的絕對定量公式計算待測組分的重量^[9]：

其中Wr為內(nèi)標物的重量，As和Ar分別為供試品特征峰和內(nèi)標峰的峰面積，Es和Er分別為供試品和內(nèi)標物的質(zhì)子當量重量（質(zhì)量）（以分子量除以特征峰的質(zhì)子數(shù)計算得到），然后根據(jù)稱樣量計算組分在樣品中的含量。

3 結果與討論

3.1 樣品制備方法的選擇

3.1.1 樣品提取條件的優(yōu)化 虎杖中有效成分提取方法已有不少研究^[25，26]，相對傳統(tǒng)的醇提法和水提法等，超聲輔助提取法更適用于虎杖中熱敏性物質(zhì)白藜蘆醇和虎杖苷的提取，提取時間短，提取率高。故采用超聲提取法。

虎杖中的白藜蘆醇和虎杖苷在70～80 ℃時會發(fā)生部分分解，強光照射也會造成部分損失^{[26，27]}，常溫下穩(wěn)定性良好。故本實驗的超聲提取在室溫進行，無強光照射，提取時間30 min，旋蒸溫度均在60 ℃以內(nèi)。

根據(jù)文獻[25，26]，以樣品2為研究對象，先用一種溶劑提取，比較了甲醇、80%甲醇、80%乙醇、丙酮、以及混合溶劑80%乙醇-丙酮（1∶1， V/V）的提取效果。結果表明， 甲醇、80%甲醇、80%乙醇以及80%乙醇-丙酮（1∶1， V/V）一次提取即可達到提取完全的效果，但測試譜圖雜峰較多，影響定量;而丙酮重復提取3次后仍可檢測到較高殘留，但譜圖雜峰較少且不干擾待測組分的定量峰。

因此考慮兩步提取的方式。選擇80%乙醇做第一步完全提取的溶劑;第二步提取選擇丙酮為溶劑凈化產(chǎn)物，結果表明，丙酮兩次提取即可基本提取完全（第三次提取產(chǎn)物旋蒸后測組分定量峰信噪比僅為17，殘留很少，基本不影響定量結果）。

實驗確定樣品提取的條件為：室溫，無強光照射，80%乙醇一次超聲提取，產(chǎn)物旋干后再經(jīng)丙酮兩次超聲提取，時間均為30 min。

3.1.2 氘代溶劑

單獨以dDMSO為溶劑時，待測樣品圖譜中白藜蘆醇和虎杖苷的定量峰旁邊存在干擾峰。嘗試dDMSO-D2O混合溶劑，兩定量峰可獲得較好分離，且沒有干擾。最終選定氘代溶劑為dDMSO-D2O（10∶1， V/V）。

3.2 內(nèi)標物的選擇

嘗試了鄰苯二甲酸氫鉀、順丁烯二酸、反丁烯二酸、對苯二甲醛、苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸、2，3，5-三碘苯甲酸。僅有2，3，5-三碘苯甲酸不與樣品峰互相干擾。故選擇2，3，5-三碘苯甲酸為內(nèi)標。

3.3 NMR峰歸屬及定量峰的確認

3.3.1 NMR峰歸屬

用2.2節(jié)的方法，分別對白藜蘆醇、虎杖苷、內(nèi)標以及3者的混合物進行NMR檢測。

3.3.2 定量峰確認

取樣品1，用2.2節(jié)的方法測得NMR譜圖（圖3A），與純品混合圖譜（圖2D）比較，選定H-2，6（6.388～6.391， d， 2H） （圖3B中峰1）為白藜蘆醇定量峰;虎杖苷定量峰為H-4（6.322～6.330，t，1H）（圖3B中峰2）;內(nèi)標峰為H-6（8.329～8.332，d，1H）（圖3B中IS）。

3.4 對2，3，5-三碘苯甲酸，白藜蘆醇和虎杖苷的含量校正

以dDMSO-D2O（4∶1， V/V）為溶劑，基準物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰H-3，6（7.917～7.935， 2H， dd）與3種純品的NMR定量峰互不干擾，故選其作為校準2，3，5-三碘苯甲酸（定量峰為H-6（8.189～8.193， 1H， d）），白藜蘆醇（定量峰H-4（6.097～6.105， 1H， t））和虎杖苷（定量峰H-4（6.322～6.330， 1H， t））含量的內(nèi)標，采用qNMR絕對定量模式對3種純品進行含量校正。實驗測得2，3，5-三碘苯甲酸含量為96.64%，RSD為0.6%;白藜蘆醇純品含量為98.64%，RSD為0.4%;虎杖苷純品含量為98.45%，RSD為0.6%。下面的實驗使用校正后的含量值進行。

3.5 方法驗證

3.5.1 精密度 稱取樣品4制備的旋干產(chǎn)物和內(nèi)標，用2.2節(jié)的方法分別在日內(nèi)和日間各做6組測試，結果白藜蘆醇峰面積/內(nèi)標峰面積（A1/Ar）日內(nèi)RSD為0.2%，日間RSD為0.5%;虎杖苷峰面積/內(nèi)標峰面積（A2/Ar）日內(nèi)RSD分別為0.4%，日間RSD為0.5%，精密度好，也說明樣品穩(wěn)定性好。

3.5.2 線性

精密稱取6組白藜蘆醇0.960～3.318 mg，分別加入虎杖苷0.860～3.500 mg和2 mg內(nèi)標，加入0.50 mL溶劑混勻，超聲溶解后按2.2節(jié)的方法獲得NMR譜圖。以（樣品/內(nèi)標）質(zhì)量比為橫坐標（x），NMR定量峰面積比為縱坐標（y），用純品對照品評價的零截距標準曲線分別為：白藜蘆醇y=4.4368x，相關系數(shù)R=0.9994;虎杖苷y=1.2885x，R=0.9995。理論計算線性曲線的斜率對白藜蘆醇為4.3797，對虎杖苷為1.2803。兩者接近，可以直接用絕對定量模式測定。

3.5.3 檢出限和定量限 qNMR檢出限（LOD）和定量限（LOQ）可由LOD=3.3σ/S，LOQ=10σ/S得到，式中σ指非零截距線性回歸曲線Y軸截距的偏差，S指非零截距線性回歸曲線斜率^[6，17]。由此算得白藜蘆醇LOD=0.057，LOQ=0.173;虎杖苷LOD=0.059，LOQ=0.179。根據(jù)本實驗中溶劑和內(nèi)標的量計算白藜蘆醇的LOD=0.23 g/L，LOQ=0.69 g/L;虎杖苷LOD=0.24 g/L，LOQ=0.72 g/L。英國藥典^[8]對核磁定量方法要求在S/N≥150∶1，這也可以作為LOQ的指標，以樣品1的NMR測定譜圖，根據(jù)絕對定量公式^[8]算得白藜蘆醇和虎杖苷的LOQ分別為0.47和1.57 g/L。綜上，本方法qNMR對白藜蘆醇和虎杖苷的LOQ分別為0.69和1.57 g/L，LOD分別為0.23和0.24 g/L。endprint

3.5.4 樣品分析 按2.2節(jié)的方法，對市售4種虎杖樣品中測定白藜蘆醇和虎杖苷的結果見表1。與相關文獻[4]中HPLC法測定飲片中白藜蘆醇（1.1～5.1 mg/g）和虎杖苷（6.3～29.0 mg/g）的含量對比，本實驗藥材飲片（樣品4）中該兩種成分含量基本相符。

3.5.5 樣品提取后qNMR方法的回收率 取樣品1提取后產(chǎn)物，用2.2節(jié)的qNMR法測定其中所含白藜蘆醇和虎杖苷的含量; 加入白藜蘆醇和虎杖苷后再測定含量，計算加標回收率。結果白藜蘆醇回收率為99.6%～102.3%，RSD為1.0%（n=6）;虎杖苷回收率為98.7%～101.1%，RSD為0.9%（n=6）。

3.5.6 包括樣品提取過程的白藜蘆醇和虎杖苷回收率

分別準確稱取6份0.5 g左右樣品1，向其中每份均加入精密稱取的白藜蘆醇和虎杖苷，用2.2節(jié)的方法提取并測定含量，計算回收率。得到包括樣品提取過程的白藜蘆醇回收率為97.7%～103.5%，RSD=2.4%（n=6）;虎杖苷回收率為94.5%～99.2%，RSD=1.6%（n=6）。考慮qNMR回收率，顯示組分提取較為完全且重現(xiàn)。

研究結果表明， 本方法可同時定量分析中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷， 方法精密度好，線性評價顯示可以直接用絕對定量公式計算含量，定量分析結果準確。

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Simultaneous Determination of Resveratrol and Polydatin in

Polygonum Cuspidatum by Quantitative Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

YU Shan1， GUO Qiang-Sheng1， WANG Hui-Lin2， GAO Jian-Ping2， XU Xu*1，3

1（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

2（Department of Pharmacology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

3（Key Laboratory of Synthetic Chemistry of Natural Substances， Shanghai Institute of Organic Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200032， China）

Abstract A quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopic （qNMR） method was established for the simultaneous determination of resveratrol and polydatin in Polygonum Cuspidatum traditional Chinese herb cuts and granule. The 2-step ultrasonic extraction method using 80% alcohol and acetone was used for fully extracting these two components in samples before qNMR determination. The qNMR experimental conditions were investigated and deuterated dimethyl sulphoxide-deuterium oxide （10∶1， V/V） was selected as solvent， the pulse delay time was 5 s， the scan number was 32， 2，3，5-triiodobenzoate was used as internal standard which was calibrated with primary standard substance of potassium hydrogen phthalate. The 1H-NMR peaks at δ 6.388-6.391 （d， 2H） of resveratrol and δ 6.322-6.330 （t， 1H） of polydatin were chosen as the quantitative peaks. Method validation was performed in terms of precision （RSD<0.6%）， linearity （correlative constants R2>0.999）， limit of detection （0.23 g/L for resveratrol and 0.24 g/L for polydatin） and limit of quantitation （resveratrol 0.69 g/L， polydatin 1.57 g/L）， recovery （resveratrol 97.7%-103.5%， RSD=2.4%， polydatin ?94.5%-99.2%， RSD=1.6%， including the sample extraction and preparaton process）. The results showed the reliability of qNMR for traditional Chinese medicine assay. The resveratrol and polydatin in Polygonum Cuspidatum real cuts and granule samples were experimental determined as 3.57-5.69 mg/g and 12.73-24.07 mg/g， respectively.

Keywords Quantitative nuclear magnetic resonance; Polygonum cuspidatum; Resveratrol; Polydatin

（Received 20 August 2014; accepted 5 October 2014）endprint