星點設計—效應面優(yōu)化牛大力多糖提取工藝

陳勇　謝臻　巫繁菁　等

摘要：利用星點設計-效應面法對牛大力多糖的提取工藝進行優(yōu)化。以提取溫度、提取時間和料液比為自變量，多糖提取率為因變量，通過對自變量各水平的多元線性回歸及二項式擬合，用星點設計-效應面法選取最佳工藝。試驗結果表明最佳工藝條件為89.3 ℃，料液比1∶32（g/mL），提取106 min，在此條件下測得多糖含量為558.5 mg/g，與預測值554.6 mg/g較接近。

關鍵詞：星點設計；效應面；牛大力；多糖

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5507-04

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia sliaopeciosa Champ.）的根[1]，俗稱山蓮藕、血藤、九龍串珠、牛古大力、大力薯[2]。性味甘平，具有補虛潤肺、強筋活絡的功效，臨床證明對腰肌勞損、風濕性關節(jié)炎、肺結核、慢性支氣管炎等有一定療效[3]。牛大力的主要化學成分為苯丙素類、三萜類化合物、植物甾醇、多糖等[4]?，F(xiàn)代藥理試驗研究結果表明，牛大力具有鎮(zhèn)咳平喘、抗肝纖維化作用，其多糖成分還具有調(diào)節(jié)免疫功能作用[5-9]。本試驗采用加熱回流提取，以多糖提取率為指標，采用星點設計-效應面法優(yōu)化了牛大力的提取工藝，確定了最佳提取工藝，為充分利用牛大力資源，及其質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛大力藥材購于玉林中藥材市場，部分采自廣西靖西縣，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學朱意麟老師鑒定為豆科植物美麗崖豆藤的根。

Agilent8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）、BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯），水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛大力多糖含量測定

1）標準品溶液制備。精密稱取干燥至衡重的葡萄糖粉末12.57 mg，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。

2）供試品溶液制備。取牛大力藥材粉末0.5 g，置于250 mL的錐形瓶中，加入去離子水32 mL，89.3 ℃加熱回流106 min，濾過，吸取濾液5 mL，加入無水乙醇20 mL不斷攪拌使之含醇量達到80%，得到均勻乳白色沉淀，放入冰箱靜置過夜。將沉淀用無水乙醇沖洗至析晶漏斗上，抽濾，棄去乙醇液。用沸水將漏斗上的多糖結晶溶解抽濾至50 mL容量瓶中，定容。

3）最大吸收波長。取葡萄糖標準品適量置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。在冰水浴中加入0.05%硫酸-蒽酮4.0 mL，靜置10 min，取出搖勻，沸水浴10 min后取出，冷卻，室溫放置30 min后，以相應試劑作空白，在400～800 nm測定光譜圖，葡萄糖標準品紫外可見光譜圖見圖1，同法操作，牛大力供試品溶液紫外可見光譜圖見圖2，全波長掃描，葡萄糖標準品溶液與牛大力供試品溶液的最大吸收波長均為628 nm，所以選擇此波長為測定波長。

4）標準曲線測定。取上述標準品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL至具塞試管中并加去離子水至1.0 mL。在冰水浴中加入0.05%硫酸-蒽酮4.0 mL，靜置10 min，取出搖勻，沸水浴10 min后取出，冷卻，室溫放置30 min，在628 nm處測定其吸光度，以1.0 mL去離子水為空白，記錄各吸光度并繪制標準曲線。

1.2.2 單因素試驗 多糖溶于水而不溶于高濃度乙醇，因此先用80%乙醇去除影響多糖含量的物質(zhì)。再用水加熱回流提取多糖，考察提取溫度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）、提取時間（20、40、60、80、100、120、140 min）、料液比（g/mL，下同）（1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40）3個因素對多糖提取率的影響。

1.2.3 星點試驗設計 因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進行回歸處理，固定提取1次。根據(jù)星點試驗設計的原理，結合單因素考察結果，以提取溫度、提取時間和料液比作為影響牛大力多糖含量的提取因素。每個因素設有5水平，因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

標準曲線見圖3。由圖3可知，葡萄糖標準品在0.007 542～0.020 112 mg/mL間呈線性關系，計算回歸方程為y=32.83x+0.038 3，r=0.999 3。

2.2 指標測定結果

2.2.1 精密度試驗結果 取同一標準品連續(xù)測定6次，吸光度平均值為0.600 81，RSD為0.46%，取同一供試品溶液連續(xù)測定6次，吸光度平均值為0.600 8，RSD為0.46%，表明本法精密度良好，。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗結果 取供試品溶液1份，每隔10 min測定吸光度，結果表明顯色后在60 min內(nèi)較穩(wěn)定，RSD為0.51%。

2.2.3 重復性試驗結果 取同一批次樣品6份，測定吸光度，其多糖含量平均值為553.835 4 mg/g，RSD為2.90%，表明本方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗結果 取已知含量本品適量，精密加入葡萄糖標準品適量，測定吸光度，平行測量6份樣品，計算加樣回收率為102.20%，RSD為1.70%。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 提取溫度 取牛大力藥材粉末0.5 g分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃下提取并測定多糖提取率，結果見圖4。由圖4可知，隨著溫度的升高，多糖溶出量逐漸增大，在100 ℃提取率達到最大值。

2.3.2 提取時間 取牛大力藥材粉末0.5 g分別提取20、40、60、80、100、120、140 min，提取1次，測定多糖提取率，結果見圖5。由圖5可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率增長緩慢，在120 min后隨著時間的延長，多糖提取率略有下降，從節(jié)省能源、減少時間周期考慮，提取時間以120 min左右為宜。

2.3.3 料液比 取牛大力藥材粉末0.5 g，按照料液比分別為1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶劑并測定多糖提取率，結果見圖6。由圖6可知，多糖提取率隨著料液比的降低而增加，1∶36時提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶劑對多糖提取率影響較弱，因此選擇料液比1∶36左右為宜。

2.4 星點試驗結果

星點試驗結果見表2。將所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件進行響應面分析。本次試驗響應曲面待擬合的方程為：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。應用STATISTICA 7.0軟件包對按星點設計矩陣獲得的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸與方差分析，得到優(yōu)化后的二項式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可見，有90.43%多糖含量歸因于這3個因素的變化，只有9.57%不被此方程所解釋。

根據(jù)擬合的二項式方程，繪制多糖隨因素變化的響應面圖，確定牛大力多糖的最佳工藝條件，結果見圖7至圖9。對二項式方程進行求導，可得：當提取條件為在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次時，Y有預測的最大值554.6 mg/g。依據(jù)最佳提取工藝條件提取牛大力，設置3個重復進行驗證試驗，測得多糖含量為558.5 mg/g。

3 小結與討論

響應面法是通過建立響應值與被考察因素的函數(shù)關系，從響應面上選擇最佳的響應值，從而推出自變量取值范圍即最佳試驗條件的方法。因此，本試驗必須采用單因素考察，方可確定合理的試驗條件。近年國內(nèi)較多利用星點設計試驗所得的信息量大、直觀的優(yōu)點應用于優(yōu)化中藥提取工藝[10，11]。因此本研究采用星點設計的方法設計試驗矩陣，對牛大力中多糖的提取工藝進行優(yōu)化，將擬合得到的二項式方程進行求導，計算多糖含量最高時各個被考察因素的取值。最終確立牛大力的最佳提取條件為89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此條件下，多糖的實際含量為558.5 mg/g，與預測值554.6 mg/g較接近。

參考文獻：

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[10] WU Q， WANG Y R， WU H. Optimization of cellulase hydrolysis extraction process of Folium ginseng by central composite design/response surface methodology[J]. Chin J Exp Tradit Med Form， 2006， 12（4）：5-8.

[11] SUN L， WANG Y R. Optimal extraction of effective constituents from Radix polygalae based on central composite design/response surface methodology[J]. Chin TraditPat Med， 2006，28（3）：328-331.

（責任編輯 龍小玲）

2.3.3 料液比 取牛大力藥材粉末0.5 g，按照料液比分別為1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶劑并測定多糖提取率，結果見圖6。由圖6可知，多糖提取率隨著料液比的降低而增加，1∶36時提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶劑對多糖提取率影響較弱，因此選擇料液比1∶36左右為宜。

2.4 星點試驗結果

星點試驗結果見表2。將所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件進行響應面分析。本次試驗響應曲面待擬合的方程為：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。應用STATISTICA 7.0軟件包對按星點設計矩陣獲得的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸與方差分析，得到優(yōu)化后的二項式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可見，有90.43%多糖含量歸因于這3個因素的變化，只有9.57%不被此方程所解釋。

根據(jù)擬合的二項式方程，繪制多糖隨因素變化的響應面圖，確定牛大力多糖的最佳工藝條件，結果見圖7至圖9。對二項式方程進行求導，可得：當提取條件為在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次時，Y有預測的最大值554.6 mg/g。依據(jù)最佳提取工藝條件提取牛大力，設置3個重復進行驗證試驗，測得多糖含量為558.5 mg/g。

3 小結與討論

響應面法是通過建立響應值與被考察因素的函數(shù)關系，從響應面上選擇最佳的響應值，從而推出自變量取值范圍即最佳試驗條件的方法。因此，本試驗必須采用單因素考察，方可確定合理的試驗條件。近年國內(nèi)較多利用星點設計試驗所得的信息量大、直觀的優(yōu)點應用于優(yōu)化中藥提取工藝[10，11]。因此本研究采用星點設計的方法設計試驗矩陣，對牛大力中多糖的提取工藝進行優(yōu)化，將擬合得到的二項式方程進行求導，計算多糖含量最高時各個被考察因素的取值。最終確立牛大力的最佳提取條件為89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此條件下，多糖的實際含量為558.5 mg/g，與預測值554.6 mg/g較接近。

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[11] SUN L， WANG Y R. Optimal extraction of effective constituents from Radix polygalae based on central composite design/response surface methodology[J]. Chin TraditPat Med， 2006，28（3）：328-331.

（責任編輯 龍小玲）

2.3.3 料液比 取牛大力藥材粉末0.5 g，按照料液比分別為1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶劑并測定多糖提取率，結果見圖6。由圖6可知，多糖提取率隨著料液比的降低而增加，1∶36時提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶劑對多糖提取率影響較弱，因此選擇料液比1∶36左右為宜。

2.4 星點試驗結果

星點試驗結果見表2。將所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件進行響應面分析。本次試驗響應曲面待擬合的方程為：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。應用STATISTICA 7.0軟件包對按星點設計矩陣獲得的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸與方差分析，得到優(yōu)化后的二項式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可見，有90.43%多糖含量歸因于這3個因素的變化，只有9.57%不被此方程所解釋。

根據(jù)擬合的二項式方程，繪制多糖隨因素變化的響應面圖，確定牛大力多糖的最佳工藝條件，結果見圖7至圖9。對二項式方程進行求導，可得：當提取條件為在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次時，Y有預測的最大值554.6 mg/g。依據(jù)最佳提取工藝條件提取牛大力，設置3個重復進行驗證試驗，測得多糖含量為558.5 mg/g。

3 小結與討論

響應面法是通過建立響應值與被考察因素的函數(shù)關系，從響應面上選擇最佳的響應值，從而推出自變量取值范圍即最佳試驗條件的方法。因此，本試驗必須采用單因素考察，方可確定合理的試驗條件。近年國內(nèi)較多利用星點設計試驗所得的信息量大、直觀的優(yōu)點應用于優(yōu)化中藥提取工藝[10，11]。因此本研究采用星點設計的方法設計試驗矩陣，對牛大力中多糖的提取工藝進行優(yōu)化，將擬合得到的二項式方程進行求導，計算多糖含量最高時各個被考察因素的取值。最終確立牛大力的最佳提取條件為89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此條件下，多糖的實際含量為558.5 mg/g，與預測值554.6 mg/g較接近。

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[11] SUN L， WANG Y R. Optimal extraction of effective constituents from Radix polygalae based on central composite design/response surface methodology[J]. Chin TraditPat Med， 2006，28（3）：328-331.

（責任編輯 龍小玲）