羊種布魯氏菌NN1202株VirB8蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

李軍　潘艷　陳澤祥　等

摘要：應(yīng)用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析羊種布魯氏菌NN1202株VirB8蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域；應(yīng)用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)。對(duì)各方法的結(jié)果綜合分析，VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域可能是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌；VirB8；抗原表位

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.26；S852.61+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5467-03

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種以人和動(dòng)物出現(xiàn)流產(chǎn)、不育和發(fā)熱為臨床特征的人獸共患細(xì)菌病，在中國(guó)人、畜間仍有該病的發(fā)生，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害[1]。布魯氏菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的細(xì)菌，動(dòng)物感染后常呈隱性，往往到性成熟或妊娠時(shí)才表現(xiàn)典型的臨床癥狀，對(duì)布魯氏菌早期感染的檢測(cè)是有效防控布魯氏菌病的關(guān)鍵?，F(xiàn)在用于布魯氏菌病檢測(cè)的主要方法是虎紅平板凝集（RBT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT），但其存在著靈敏度低和非特異性的缺點(diǎn)，因此，建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的ELISA方法具有重要的意義。

VirB8蛋白是布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)的一個(gè)早期分泌蛋白[2]，鐘旗等[3]的研究表明，缺失VirB8基因的豬種布魯氏菌變異株感染BALB/c小鼠后，可保護(hù)小鼠抵抗親本細(xì)菌的攻擊，證實(shí)VirB8基因與布魯氏菌毒力密切相關(guān)。VirB8基因同源性比較表明，其在布魯氏菌種間的同源性高度保守[4]，因此，VirB8基因可以作為布魯氏菌基因缺失疫苗、鑒別診斷方法的一個(gè)靶基因。張劍等[5]對(duì)牛種布魯氏菌VirB8基因進(jìn)行原核表達(dá)后，以表達(dá)的蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法與虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率達(dá)97.02%，證明了以VirB8蛋白作為包被蛋白建立間接ELISA的可行性。但是，原核表達(dá)蛋白存在著蛋白純化、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)，而以抗原表位序列為基礎(chǔ)的人工合成抗原多肽有效解決了這些問(wèn)題。本研究擬對(duì)羊種布魯氏菌VirB8蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，為后續(xù)VirB8蛋白的抗原多肽合成提供信息。

1 材料與方法

1.1 羊種布魯氏菌NN1202株VirB8基因序列

羊種布魯氏菌NN1202株VirB8基因序列為本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增、測(cè)序所得[4]?；蛐蛄幸呀?jīng)登錄NCBI GenBank，登錄號(hào)JQ768413。以此基因的推導(dǎo)氨基酸序列為研究對(duì)象進(jìn)行VirB8蛋白的B細(xì)胞抗原表位分析。

1.2 VirB8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析VirB8蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域[6，7]。

1.3 VirB8蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

運(yùn)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析VirB8蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)，綜合各方法的結(jié)果并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上VirB8蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)進(jìn)行綜合分析[8-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 VirB8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，VirB8蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域（25-33、36-39、41-45、64-73位氨基酸）；7個(gè)β-折疊區(qū)域（52-64、73-82、107-116、160-169、172-186、193-207、235-239位氨基酸）。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的9個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和11個(gè)卷曲區(qū)域（圖1）。

2.2 VirB8蛋白的氨基酸親水性分析

Kyte-Doolittle方法（圖2）分析表明，VirB8蛋白有2-22、37-45、93-97、116-127、135-158、181-196、229-233等7個(gè)氨基酸親水性區(qū)域（≥0.5）。

2.3 VirB8蛋白的柔性區(qū)域分析

Karplus-Schulz方法（圖3）分析表明，VirB8蛋白有多個(gè)柔性區(qū)域，主要位于4-22、38-43、79-87、89-96、115-116、123-127、134-142、144-162、169-178、182-196、213-221和231-235位氨基酸區(qū)域。

2.4 VirB8蛋白的溶劑表面可及性分析

Emini方法（圖4）分析表明，3-16、39-43、91-97、100-107、115-127、134-141、145-155、181-195和229-232位氨基酸區(qū)域出現(xiàn)在VirB8蛋白溶劑表面可及性較大（≥1）。

2.5 VirB8蛋白的抗原指數(shù)分析

Jameson-Wolf方法（圖5）分析表明，VirB8蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域（≥0）有：1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域，以C端區(qū)域的抗原指數(shù)較高，跨度較大，存在抗原表位的可能性也較大。

2.6 VirB8蛋白B細(xì)胞表位綜合分析

應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性，抗原指數(shù)也較高，結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有容易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域，因此，這些區(qū)域極有可能是VirB8蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個(gè)蛋白構(gòu)成的一類(lèi)分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細(xì)胞后，VirB蛋白在布氏小體運(yùn)輸?shù)骄W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的過(guò)程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強(qiáng)。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應(yīng)用于牛種布魯氏菌病的檢測(cè)，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）對(duì)布魯氏菌病的檢測(cè)方法中，已經(jīng)將ELISA方法列為血清學(xué)檢測(cè)方法。

通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是人工合成多肽的基礎(chǔ)[15]。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定了B細(xì)胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，在蛋白內(nèi)部中起著“支撐”作用，成為B細(xì)胞抗原表位的概率低；而轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域?qū)儆凇叭嵝浴苯Y(jié)構(gòu)，暴露在蛋白表面，與抗體結(jié)合的幾率大，成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細(xì)胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對(duì)此進(jìn)行了改良，以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí)，蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].第五版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] ROUOT B， ALVAREZ-MARTINEZ M T， MARIUS C. Production of the type IV secretion system differs among Brucella species as revealed with VirB5-and VirB8-specific antisera [J]. Infection and Immunity， 2003， 71： 1075-1082.

[3] 鐘 旗，何倩倪，范偉興，等.布魯氏菌VirB8變異株的構(gòu)建及其感染力和毒力的測(cè)定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（6）：892-897.

[4] 李 軍，陳澤祥，楊 威，等.廣西家畜布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（7）：754-758.

[5] 張 劍，馬衛(wèi)明，張 亮，等.牛布魯氏菌毒力基因Virb8間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（16）：3460-3469.

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[13] NAROENI A，JOUY N，OUAHRANI-BETTACHE S， et al. Brucella suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane modifications[J]. Infect Immun，2001，69（1）：486-493.

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[15] 張洪勇，金寧一.合成肽疫苗的分子設(shè)計(jì)[J].生物技術(shù)通訊，2003，14（2）：145-147.

[16] 來(lái)魯華.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子設(shè)計(jì)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1993.

（責(zé)任編輯 程碧軍）

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個(gè)蛋白構(gòu)成的一類(lèi)分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細(xì)胞后，VirB蛋白在布氏小體運(yùn)輸?shù)骄W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的過(guò)程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強(qiáng)。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應(yīng)用于牛種布魯氏菌病的檢測(cè)，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）對(duì)布魯氏菌病的檢測(cè)方法中，已經(jīng)將ELISA方法列為血清學(xué)檢測(cè)方法。

通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是人工合成多肽的基礎(chǔ)[15]。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定了B細(xì)胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，在蛋白內(nèi)部中起著“支撐”作用，成為B細(xì)胞抗原表位的概率低；而轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域?qū)儆凇叭嵝浴苯Y(jié)構(gòu)，暴露在蛋白表面，與抗體結(jié)合的幾率大，成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細(xì)胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對(duì)此進(jìn)行了改良，以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí)，蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點(diǎn)。

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[13] NAROENI A，JOUY N，OUAHRANI-BETTACHE S， et al. Brucella suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane modifications[J]. Infect Immun，2001，69（1）：486-493.

[14] CARLESSON H E， HURVELL B， LINDBERG A A. Enzyme-linkerd immunosorbent assay for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica[J]. Acta Pathol Microbiol Scand C， 1976， 84（3）： 168-176.

[15] 張洪勇，金寧一.合成肽疫苗的分子設(shè)計(jì)[J].生物技術(shù)通訊，2003，14（2）：145-147.

[16] 來(lái)魯華.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子設(shè)計(jì)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1993.

（責(zé)任編輯 程碧軍）

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個(gè)蛋白構(gòu)成的一類(lèi)分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細(xì)胞后，VirB蛋白在布氏小體運(yùn)輸?shù)骄W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的過(guò)程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強(qiáng)。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應(yīng)用于牛種布魯氏菌病的檢測(cè)，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）對(duì)布魯氏菌病的檢測(cè)方法中，已經(jīng)將ELISA方法列為血清學(xué)檢測(cè)方法。

通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是人工合成多肽的基礎(chǔ)[15]。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定了B細(xì)胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，在蛋白內(nèi)部中起著“支撐”作用，成為B細(xì)胞抗原表位的概率低；而轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域?qū)儆凇叭嵝浴苯Y(jié)構(gòu)，暴露在蛋白表面，與抗體結(jié)合的幾率大，成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細(xì)胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對(duì)此進(jìn)行了改良，以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí)，蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 程碧軍）