基于HER2靶點(diǎn)的乳腺癌細(xì)胞多模態(tài)顯像研究

付婷婷 尹勝男 朱靜芬 程 亮 李勇剛

2 蘇州大學(xué)功能納米與軟物質(zhì)研究院

乳腺癌是臨床上常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位，已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病[1]。高表達(dá)HER2受體的乳腺癌惡性程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早、術(shù)后易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差[2]。因此，在體檢測(cè)乳腺癌HER2受體表達(dá)水平，對(duì)于手術(shù)方案的制訂、術(shù)后復(fù)發(fā)與殘留灶的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)后評(píng)估均具有十分重要的臨床意義。Trastuzuma是一種人源性IgG1單克隆抗體，能與HER2受體的膜外段高效、特異性結(jié)合，其親合常數(shù)（Kd）為0.1nM，已應(yīng)用于乳腺癌的臨床靶向治療[3-5]。本課題采用稀土上轉(zhuǎn)換光學(xué)材料氟化鈉釓（UCNP）納米晶體標(biāo)記Trastuzumab，構(gòu)建基于UCL/MRI多模態(tài)顯像的靶向納米顆粒UCNPPEG-Trastuzumab，體外行細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)及UCL/MRI多模態(tài)顯像,檢測(cè)其結(jié)合效率。采用上轉(zhuǎn)換光學(xué)成像、MRI T1加權(quán)成像（T1WI），探討基于HER2靶點(diǎn)的多模態(tài)顯像用于乳腺癌靶向診斷的可行性及價(jià)值。

方 法

1.材料

1.1 主要試劑：本實(shí)驗(yàn)所用稀土元素(Gd、Yb、Er)均為上?；瘜W(xué)工業(yè)有限公司產(chǎn)品，有機(jī)溶劑(OA、ODE)、MTT及有機(jī)高分子（PEG）為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，胎牛血清和DAPI為美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)買于Thermo Scientific公司，SKBR3細(xì)胞由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 主要儀器：酶標(biāo)儀、共聚焦顯微鏡，3.0T MRI等。

2.UCNP的合成、表征與修飾

通過(guò)熱分解法將稀土氧化物與三氟乙酸反應(yīng)制得的三氟乙酸鹽作為先驅(qū)體，加入到高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑（OA、ODE體系)中，在惰性氣體氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫到320℃左右，使三氟乙酸鹽熱分解生成稀土氟化物NaGdF4（UCNP）。

通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)的表征，可以觀察納米微粒的形貌和粒子大小，徑粒分布情。用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)（ICP）測(cè)得UCNP的濃度。

合成的UCNP材料表面為疏水基，通過(guò)聚合物包覆法用已合成的高分子C18PMH-PEG在氯仿中修飾UCNP，修飾后，UCNP-C18PMH-PEG（簡(jiǎn)稱UCNPPEG）在水相中溶解度好。

3.UCNP-PEG與抗體連接，即UCNP-PEGTrastuzumab的制備

在pH=7.2～7.4的條件下，以EDC作為催化劑，用Sulfo-SMCC活化UCNP-PEG；用trant’s試劑、Herceptin抗體及EDTA溶液在pH=8的條件下完成抗體的巰基化偶聯(lián)；將巰基化的抗體與活化的UCNP-PEG混合，反應(yīng)24h，合成UCNP-PEG-Trastuzumab顆粒。

4.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT）

UCNP-PEG取9個(gè)濃度梯度，分別是400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6μg/ml，孵育24h后，加入MTT（5mg/ml），4h后除去培養(yǎng)基和材料混合物，加入DMSO，選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

5.SKBR3細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)記后體外UCL/MRI成像

5.1 共聚焦顯微鏡成像（Confocal）：以1×105/ml的細(xì)胞濃度進(jìn)行細(xì)胞接種并培養(yǎng)過(guò)夜，20μg/ml濃度的UCNP-PEG-Trastuzumab、UCNP-PEG與SKBR3細(xì)胞共孵育30min后，反復(fù)PBS沖洗未結(jié)合材料，加入4%甲醛固定細(xì)胞，DAPI染細(xì)胞核，反復(fù)PBS沖洗染液，進(jìn)行共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)光波長(zhǎng)為980nm。

5.2 體外MRI成像：分別設(shè)置water（水）、untreated（純SKBR3細(xì)胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育細(xì)胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育細(xì)胞）四組，純細(xì)胞作為空白組，加入20μg/ml濃度的非靶向探針UCNP-PEG的為對(duì)照組，加入20μg/ml濃度的UCNP-PEG-Trastuzumab的為實(shí)驗(yàn)組，材料與細(xì)胞孵育30min，均用PBS洗去未結(jié)合材料，然后四組樣品均置于2ml EP管中，進(jìn)行MRI成像并測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度。

掃描條件：采用腕關(guān)節(jié)線圈，選擇快速自旋回波序列進(jìn)行T1WI掃描，掃描參數(shù)：TR 440ms，TE 149ms，視野60mm，層厚2mm，無(wú)間距掃描，矩陣256×192，采集次數(shù)4，翻轉(zhuǎn)角90°。

結(jié) 果

1.UCNP的形貌與光學(xué)特性

透射電鏡（TEM）顯示其形態(tài)為球形，粒徑約為60nm左右（圖1）。高分子C18PMH-PEG修飾的UCNP在去水中具有很好的分散性，通過(guò)ICP測(cè)試濃度為1mg/ml，UCNP的上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜，可以發(fā)現(xiàn)其發(fā)射光譜范圍為500～700nm，峰值為540nm（圖2）。溶于水的UCNP-PEG在980nm激發(fā)光下的樣品，可見發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光（圖3）。

2.UCNP-PEG對(duì)SKBR3細(xì)胞的毒性分析

UCNP-PEG與細(xì)胞共孵育24h后，其對(duì)細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)濃度的UCNP-PEG對(duì)SKBR3細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性（圖4）。

3.SKBR3細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)記后體外UCL/MRI成像

結(jié)果

在Confocal成像中，實(shí)驗(yàn)組UCNP-PEGTrastuzumab處理的SKBR3細(xì)胞膜表面可見均勻分布的綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)無(wú)熒光，而對(duì)照組UCNP-PEG處理的SKBR3細(xì)胞則無(wú)此顯像（圖5），由此證明靶向探針UCNP-PEG-Trastuzumab可以與膜受體HER2特異性結(jié)合。

圖1 UCNP投射電鏡圖像，UCNP為大小均勻的類圓形球狀結(jié)構(gòu)，大小為60nm。圖2 UCNP的上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜，其發(fā)射光譜范圍為500～700nm，峰值為540nm。

圖3 UCNP-PEG-Trastuzumab在可見光與980nm激發(fā)光下的圖片。A.可見光下為透澄清的液體。B.980nm激發(fā)光下發(fā)出較亮的綠光。

圖4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT），在對(duì)照組不加材料，九組不同材料濃度下的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率均在85%以上。圖5 Confocal圖像，實(shí)驗(yàn)組UCNP-PEG-Trastuzumab處理細(xì)胞周圍可見均勻分布的環(huán)形綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)無(wú)熒光，而對(duì)照組UCNP處理細(xì)胞內(nèi)外均無(wú)UCNP熒光。

四組樣品經(jīng)MRI 掃描示靶向探針UCNP-PEGTrastuzumab處理的HER2表達(dá)陽(yáng)性的SKBR3細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度為510，呈明顯短T1高信號(hào)；非靶向探針UCNPPEG處理的對(duì)照組細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度為360，呈T1稍高信號(hào)；空白組MR掃描信號(hào)強(qiáng)度為329，呈T1等信號(hào)；水信號(hào)強(qiáng)度為206，呈T1低信號(hào)（圖6）。

圖6 MRI T1加權(quán)像，water（水）、untreated（純Sk-br-3細(xì)胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育細(xì)胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育細(xì)胞）四組在MRI T1WI上信號(hào)強(qiáng)度分別為206、329、360、510，呈由暗到亮的梯度變化。

討 論

乳腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，并已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病，根據(jù)2010年中國(guó)人口協(xié)會(huì)發(fā)布的《中國(guó)乳腺疾病調(diào)查報(bào)告》顯示：我國(guó)城市地區(qū)乳腺癌的病死率增長(zhǎng)了38.91%，發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位[1]。各型乳腺癌中，HER2受體高表達(dá)的乳腺癌惡性程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早、術(shù)后易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差[2]，本實(shí)驗(yàn)探索性的研究了對(duì)HER2受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行靶向成像的新技術(shù)，其對(duì)于該型乳腺癌手術(shù)方案的制訂、術(shù)后復(fù)發(fā)與殘留灶的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)后評(píng)估均具有十分重要的臨床意義。

光學(xué)成像技術(shù)具有非電離、非接觸、高靈敏度、高通量和低成本的優(yōu)點(diǎn)，而且可以提供細(xì)胞或分子水平的信息，幾乎是單分子敏感；但由于生物組織對(duì)可見光具有較強(qiáng)吸收和散射作用，導(dǎo)致可見光在生物組織中的穿透深度較淺和圖像信噪比較差，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，不能很好的顯示組織解剖和生理細(xì)節(jié)。MRI在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，具有較好的空間分辨率、軟組織分辨率和無(wú)輻射特點(diǎn)，可以提供充分的解剖信息，對(duì)乳腺癌的檢查有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，由于缺乏分子水平成像能力和較低敏感性，對(duì)早期乳腺癌與轉(zhuǎn)移病灶診斷困難[6]。

稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNP），作為一種新型的光學(xué)材料，其具有獨(dú)特的多光子激發(fā)特征，能在近紅外光（980nm）的激發(fā)下發(fā)射出短波長(zhǎng)的可見光（綠光），實(shí)現(xiàn)光子能量的上轉(zhuǎn)換，因而具有更好的光學(xué)穩(wěn)定性和近紅外激發(fā)光的強(qiáng)組織穿透性[7-8]。UCNP中各稀土元素比例分別為Gd78%、Yb20%、Er2%，而UCNP中含有的稀土元素Gd對(duì)T1弛豫時(shí)間影響較大，可通過(guò)縮短氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間而影響組織的T1弛豫時(shí)間，所以作為MR成像的T1WI造影劑，UCNP成功的將光學(xué)成像與MRI相結(jié)合，可結(jié)合不同成像方法的優(yōu)點(diǎn)，克服單種成像方式的不足，形成兼顧空間分辨率、成像深度、軟組織分辨率、敏感性、細(xì)胞水平成像能力的探針技術(shù)，UCNP可用于多模態(tài)顯像的研究[9]。乳腺癌分子靶向治療藥物Trastuzumab（曲妥珠單抗）能與HER2受體的膜外段高效、特異性結(jié)合[10-12]，最后用高分子C18PMHPEG修飾UCNP，使其具有水溶性，并提供氨基，為連接Trastuzumab提供橋梁，合成的UCNP-PEGTrastuzumab可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HER2高表達(dá)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞靶向標(biāo)記與成像。

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)以及UCNP成像特點(diǎn)，選擇濃度為20μg/ml的UCNP-C18PEG-Trastuzumab進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而Confocal成像和MRI成像均說(shuō)明UCNP-PEGTrastuzumab對(duì)SKBR3細(xì)胞有特異性吸附，并說(shuō)明可以對(duì)SKBR3細(xì)胞靶向成像。對(duì)比20μg/ml的UCNPPEG-Trastuzumab和UCNP-PEG對(duì)SKBR3細(xì)胞的靶向結(jié)合能力，經(jīng)非靶向探針UCNP-PEG處理過(guò)的細(xì)胞T1WI呈稍高信號(hào)，可能是由于UCNP-PEG沉積在細(xì)胞間隙未能被PBS 徹底洗滌所致。

總之，UCNP-PEG融合了光學(xué)和核磁共振成像技術(shù)，再與Trastuzumab連接后，可以對(duì)HER2受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞行細(xì)胞靶向成像[13-15]。本實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了UCNP-PEG-Trastuzumab作為一種乳腺癌細(xì)胞成像特異性多功能探針的潛力，UCNP-PEG對(duì)SKBR3細(xì)胞毒性微小，由于在UCNP發(fā)射光譜范圍內(nèi)時(shí)，人體自發(fā)光背景干擾較小，用UCNP-PEG-Trastuzumab標(biāo)記SKBR3細(xì)胞具有較高的敏感性，為進(jìn)一步的活體實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)，通過(guò)光學(xué)和MRI靶向成像為乳腺癌個(gè)體化治療提供影像學(xué)依據(jù)。

此外，作為探索性研究，本實(shí)驗(yàn)未探討探針濃度、成像時(shí)間及腫瘤HER2表達(dá)水平與光學(xué)、MRI信號(hào)之間相關(guān)性，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入研究課題。本課題組自行制備的多功能靶向探針具有良好的光學(xué)和磁學(xué)特性，體外細(xì)胞成像顯示出針對(duì)乳腺癌HER2靶向成像效果，為下一步進(jìn)行體內(nèi)成像研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]徐雅莉,孫 強(qiáng).乳腺癌高危因素.腫瘤防治研究,2010,37:1201-1205.

[2]Fehm T,Muller V,Aktas B,et al.HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer:a prospective,multicenter trial.Breast Cancer Res Treat,2010,124:403-412.

[3]Capala J,Bouchelouche K.Molecular imaging of HER2-positive breast cancer:a step toward an individualized ’imageand treat’strategy.Curr Opin Oncol,2010,22:559-566.

[4]Milenic DE,Wong KJ,Baidoo KE,et al.Targeting HER2:a report on the in vitro and in vivo pre-clinical data supporting trastuzumab as a radioimmunoconjugate for clinical trials.MAbs.2010,2:550-564.

[5]Cameron DA,Stein S.Drug insight:intracellular inhibitors of HER2--clinical development of lapatinib in breast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2008,5:512-520.

[6]汪登斌,譚 令,江 浩,等.乳腺癌MRI研究.中國(guó)醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)成像雜志,2002,8:23-27.

[7]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Lymphatic Imaging Using PEGylated Up-conversion Nanoparticles.Nano Res,2010,3:722-732.

[8]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Imaging of Upconversion Nanoparticles with Emissions Tuned by Luminescence Resonance Energy Transfer.J.Phys.Chem.C,2011,115:2686-2692.

[9]Dev K.Chatterjee,Abdul J.Rufaihah,and Yong Zhang,Upconversion Fluorescence Imaging of Cells and Small Animals Using Lanthanide Doped Nanocrystals’,Bioma terials,2008,29:937-43.

[10]Tai W,Mahato R,Cheng K.The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery.J Control Release,2010,146:264-275.

[11]Nahta R,Yu D,Hung MC,et al.Mechanisms of disease:understanding resistance to HER2-targeted therapy in humanbreast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2006,3:269-280.

[12]Shadidi M,Sioud M.Identification of novel carrier peptides forthe specific delivery of therapeutics into cancer cells.FASEB J,2003,17:256-258.

[13]Zhang W,Chen Y,Guo DJ,et al.The synthesis of aD-glucosamine contrast agent,Gd-DTPA-DG,and its application in cancer molecular imaging with MRI.Eur J Radiol,2011,79:369-374.

[14]Crich SG,Lanzardo S,Alberti D,et al.Magnetic resonance imaging detection of tumor cells by targeting low-density lipoprotein receptors with Gd-loaded low-density lipoprotein particles.Neoplasia,2007,9:1046-1056.

[15]Meng Q,Li Z.Molecular imaging probes for diagnosis and therapy evaluation of breast cancer.Int J Biomed Imaging,2013,2013:230487.