細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3在大鼠靜脈移植物中的表達(dá)及意義

黃進(jìn)啟 姚元波▲ 向 水 蔡彥力 鄭 勇 劉金平 .湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心胸外科，湖北恩施 445000；.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，湖北 武漢 4300

冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG） 后靜脈移植物再狹窄嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期預(yù)后[1]。研究表明靜脈移植物再狹窄的病理過程是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）遷移并增殖引起中層增厚和內(nèi)膜增生，最終導(dǎo)致血管重構(gòu)和管腔狹窄，其啟動和加速進(jìn)展的關(guān)鍵和核心因素是炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的“瀑布樣”級聯(lián)放大的炎性反應(yīng)[2-4]。大多數(shù)細(xì)胞因子通過janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 研究表明，JAK2/STAT3 在VSMC 從靜止收縮表型向合成分泌表型轉(zhuǎn)換及遷移增殖等病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]，而細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3（SOCS3）是JAK2/STAT3 信號通路的經(jīng)典及特異性負(fù)反饋抑制劑[6]。 研究表明，SOCS3 通過抑制JAK2/STAT3 信號通路的下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄子STAT3 激活及其磷酸化在多種炎癥相關(guān)性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7-10]。 然而SOCS3 在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中表達(dá)是否異常及可能的相關(guān)機(jī)制，目前不清楚。 本實(shí)驗(yàn)借助大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型和體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖模型，檢測大鼠靜脈移植物早期病變過程中的相關(guān)炎癥細(xì)胞因子、STAT3 及SOCS3 的表達(dá)情況，初步探討SOCS3在靜脈移植物再狹窄過程中的可能作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

36 只雄性健康SD 大鼠（2～3 月齡大，體重300～330 g） 購買于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：00018829，00018364）。 大鼠SOCS3 重組腺病毒pYrAd-rSOCS3 及對照病毒pYrAd-GFP 由武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司合成，1640 和DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibico 公司。 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）（50 μg，400-20）購自Sigma 公司，一抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（AB-P-R-001）購于杭州賢至生物科技有限公司， 一抗SATA3（NBP1-19206）、SOCS3（NB600-1075）、磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 （P-STAT3）（NBP1-74611）、單核細(xì)胞趨化蛋白1 （MCP-1）（NBP1-07034）、 白介素1β （IL-1β）（NB110-57113）、 細(xì)胞間黏附分子1 （ICAM-1）（NB500-318）購自美國Novus 公司，一抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）（SC-1350）、白介素6（IL-6）（SC-1265）購自美國Santa Cruz 公司。 PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。顯微手術(shù)器械包及縫線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及取材 將36 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分成兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組，各18 只。實(shí)驗(yàn)組采用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，去除頸部毛發(fā)，行頸部正中切口。 全身肝素化（150 U/kg，皮下注射）后游離右側(cè)頸外靜脈及頸總動脈，切取2 cm 長的靜脈于肝素鹽水中保存?zhèn)溆?。于頸總動脈中段切除5 mm，采用標(biāo)準(zhǔn)顯微外科技術(shù)， 用11-0 尼龍線將大鼠頸外靜脈遠(yuǎn)近端顛倒翻轉(zhuǎn)間斷縫合8-10 針端吻合于頸總動脈上，開放后遠(yuǎn)端動脈搏動明顯視為血流通暢，吻合成功。對照組行假手術(shù)，只游離頸外靜脈和頸總動脈。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)，分別于術(shù)后第1、3、7 天取出移植靜脈，對照組取出相應(yīng)長度的頸外靜脈，每個時間點(diǎn)6 只。 取出的靜脈立即分成兩等份置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用差異組織貼塊法分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈原代VSMC，α-肌動蛋白（α-actin）免疫熒光法鑒定VSMC， 第3～8 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。TCID50 法 測 定pYrAd-rSOCS3 及pYrAd-GFP 滴 度均為2×1010pfu/mL。 按感染復(fù)數(shù)40 感染VSMC，感染效率在95%以上。制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以3×105個細(xì)胞/孔加入24 孔板中，每組6 孔，加入無血清DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 同步化細(xì)胞，換為10%胎牛血清（FBS）DMEM 培養(yǎng)基。 實(shí)驗(yàn)組分為bFGF 組、bFGF+pYrAd-GFP 組、bFGF+pYrAd-rSOCS3組。 對照組不加刺激因子，bFGF 組只加50 ng/mL 濃度的bFGF 刺激，bFGF+pYrAd-GFP 組和bFGF+pYrAd-rSOCS3 組分別滴加復(fù)數(shù)為40 的pYrAd-GFPp 及YrAd-rSOCS3 預(yù)孵育2 h 后，再加bFGF 刺激，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 收集細(xì)胞。

1.2.3 Real time-PCR 檢測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、SOCS3 mRNA 表達(dá) 從液氮罐中取出1 份移植靜脈，轉(zhuǎn)入另一離心管中，立即碾碎，收集細(xì)胞，分別加入1 mL Trizol。 按照試劑盒說明書步驟依次加入氯仿、異丙醇提取總RNA，最后用4℃無水乙醇清洗3 次，室溫放置10 min 晾干，溶于20 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。 取少量樣本用分光光度計(jì)測定并計(jì)算出RNA 濃度。 取各樣本總RNA 5 μg，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為42℃60 min，95℃5 min。 反應(yīng)體系總量為20 μL。PCR 擴(kuò)增：引物序列設(shè)計(jì)見表1。 反應(yīng)體系總量為20 μL，組成如下：10 倍稀釋的cDNA 4 μL，水5.2 μL，SYBR Green/Fluroescein qPCR Master Mix（2×）（Invitrogen）10 μL， 上下游引物各0.4 μL。 置入Eco real time-PCR 儀。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95°C 30 s，60℃30 s，72℃延伸10 min，循環(huán)40 周。 使用比較閾值法來測定目的基因的相對表達(dá)量，即實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的倍數(shù)，記作2－△△Ct；-△△Ct=（Ct 目的基因-Ct 管家基因） 實(shí)驗(yàn)組-（Ct 目的基因-Ct 管家基因） 對照組，Ct 是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的臨界循環(huán)數(shù)值。

表1 引物序列

1.2.4 Wertern blotting 檢 測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3、P-STAT3、SOCS3蛋白表達(dá) 從液氮罐中取出另一份移植靜脈放入EP管中，收集細(xì)胞，均立即置于冰上，移液器分別滴加細(xì)胞裂解液150 μL 和蛋白酶抑制劑4 μL，靜置30 min，4℃、10 000 r/min 離心5 min，提取上清。 上清液中包含提取的總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。 取樣品蛋白40 μg 依次進(jìn)行電泳和濕轉(zhuǎn)， 用濃度為5%的脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h。 分別滴加不同比例稀釋過的相應(yīng)鼠抗多克隆抗體磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（1∶800）、IL-6（1∶400）、MCP-1（1∶1200）、TNF-α（1∶800）、IL-1β（1∶2500）、ICAM-1（1∶800）、STAT3（1∶800）、PSTAT3（P Ser727，1∶800）及SOCS3（1∶800），4℃冰箱中過夜孵育，TBST 緩沖液沖洗硝酸纖維素膜10 min×3次。 滴加稀釋度為1∶2000 的驢抗羊二抗辣根過氧化物酶（HRP），室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次。按照ECL 發(fā)光試劑盒說明書要求在暗室內(nèi)發(fā)光曝光。應(yīng)用圖像分析處理軟件Glyo Bandscan 4.3 分析相應(yīng)的目的蛋白和內(nèi)參電泳條帶的灰度值，目的蛋白相對表達(dá)水平等于目的蛋白條帶灰度值與樣本GAPDH灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較運(yùn)用單因素ANVOA 分析及Student-Newman-keuls t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植靜脈mRNA、蛋白表達(dá)

取材時檢查發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組所有的移植靜脈內(nèi)血流均通暢， 術(shù)后1 周時移植靜脈內(nèi)膜均有不同程度增生， 說明成功建立大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型。Real time-PCR 和Wertern blotting 檢測移植靜脈中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植靜脈中的IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3（僅檢測蛋白）、P-STAT3（僅檢測蛋白）、SOCS3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均在術(shù)后1 周內(nèi)均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2、3。

2.2 VSMC 中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平

Real time-PCR 和Western blotting 檢測VSMC 中各細(xì)胞因子的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對照組比較，bFGF 組中上述指標(biāo)mRNA 和蛋白表達(dá)明顯上調(diào) （P ＜0.05 或P ＜0.01）； 與bFGF 組比較，bFGF+pYrAd-rSOCS3 組中SOCS3 的mRNA 和蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（P ＜0.01、P ＜0.05），而IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)以及STAT3、P-STAT3 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。bFGF 組與bFGF+pYrAd-GFP組比較，上述指標(biāo)mRNA 和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表4、5。

3 討論

3.1 VSMC 受bFGF 刺激后炎癥細(xì)胞因子的變化

CABG 術(shù)后自體大隱靜脈再狹窄的病理過程主要包括早期血栓形成、中期內(nèi)膜增生和晚期粥樣硬化。炎性反應(yīng)是其始動促發(fā)因素并成級聯(lián)放大始終貫穿于整個病理過程中[2]。 急性炎性反應(yīng)可在大隱靜脈吻合到升主動脈和冠狀動脈間后數(shù)小時即出現(xiàn)并持續(xù)到數(shù)周。 從獲取大隱靜脈時的牽拉、缺血缺氧到置身于動脈環(huán)境中后受到高速動脈血流的沖刷及剪切應(yīng)力的作用均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損及功能失調(diào)。內(nèi)皮屏障功能完整性的破壞及內(nèi)膜下的裸露可招募并激活血小板、白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞并形成血栓。 這些表型轉(zhuǎn)換及功能失調(diào)的內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子及黏附分子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生急性炎性反應(yīng)。 炎癥因子促使VSMC 從靜止收縮表型轉(zhuǎn)換為合成分泌表型，同時合成分泌大量具有促炎活性的介質(zhì)促使炎性反應(yīng)呈“瀑布樣”級聯(lián)放大。 表型改變的VSMC 即從中層遷移至內(nèi)膜并增殖[3-4]，細(xì)胞外基質(zhì)降解并沉積，最終引起內(nèi)膜增生、粥樣硬化等血管重構(gòu)，導(dǎo)致管腔狹窄和閉塞。本研究表明，在大鼠自體頸外靜脈移植到頸總動脈術(shù)后1 周的早期階段， 移植物中的炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 明顯表達(dá)上調(diào)， 說明出現(xiàn)明顯的急性炎性反應(yīng)。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，VSMC 受到bFGF 刺激后， 其分泌上述炎癥細(xì)胞因子明顯增加。

表2 實(shí)驗(yàn)組移植靜脈mRNA 表達(dá)（±s，n=6）

表2 實(shí)驗(yàn)組移植靜脈mRNA 表達(dá)（±s，n=6）

注：對照組結(jié)果均為（1.00±0.00）；與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子1；SOCS3：細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

時間 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3第1 天第3 天第7 天2.01±0.41*2.79±0.24**3.60±0.51**2.03±0.40*2.55±0.45**3.69±0.51**2.08±0.38*2.91±0.51**4.86±0.74**1.60±0.28 1.87±0.30*2.73±0.52**1.42±0.32 1.74±0.38*1.97±0.35*1.21±0.18 1.58±0.26 1.93±0.38*

表3 兩組移植靜脈蛋白表達(dá)（±s，n=6）

表3 兩組移植靜脈蛋白表達(dá)（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子1；STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子；P-STAT3：磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子；SOCS3：細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組第1 天第3 天第7 天實(shí)驗(yàn)組第1 天第3 天第7 天0.30±0.07 0.25±0.04 0.35±0.05 0.74±0.13 0.62±0.12 0.85±0.17 0.33±0.08 0.41±0.11 0.29±0.07 0.22±0.03 0.27±0.04 0.19±0.04 0.17±0.02 0.15±0.03 0.21±0.02 0.24±0.06 0.30±0.07 0.21±0.05 0.32±0.04 0.28±0.05 0.37±0.10 0.37±0.08 0.42±0.12 0.30±0.10 1.11±0.26**1.63±0.35**1.52±0.37**1.23±0.27 1.46±0.25*1.90±0.31*1.11±0.24**1.51±0.27**1.66±0.30**0.53±0.16 0.58±0.15*0.74±0.17**0.65±0.12**1.02±0.39**1.02±0.18**1.14±0.27**1.35±0.31**1.50±0.36**0.92±0.27**1.60±0.37**1.54±0.39**1.14±0.21**0.82±0.18*0.75±0.17*

表4 VSMC 中的mRNA 表達(dá)水平（±s，n=3）

表4 VSMC 中的mRNA 表達(dá)水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與bFGF 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子1；SOGS3：細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.00 1.57±0.31*1.56±0.28 1.28±0.25△1.00±0.00 2.08±0.37**2.14±0.17 1.17±0.23△1.00±0.00 3.06±0.52**3.28±0.61 1.37±0.23△△1.00±0.00 1.71±0.19*1.73±0.34 1.48±0.21△1.00±0.00 2.10±0.27**2.09±0.35 1.34±0.21△1.00±0.00 2.37±0.24**2.31±0.31 5.47±1.03△△

表5 VSMC 中的蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）

表5 VSMC 中的蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.01；與bFGF 組比較，△P ＜0.05；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子1；STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子；P-STAT3：磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子；SOCS3：細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.23 2.36±0.48*2.10±0.42 1.68±0.39△0.83±0.19 1.66±0.43*1.67±0.42 1.25±0.21△0.64±0.15 1.54±0.31*1.65±0.30 1.20±0.24△0.67±0.15 1.49±0.35*1.55±0.36 1.00±0.24△0.61±0.11 1.41±0.28*1.31±0.30 0.99±0.21△0.56±0.17 1.30±0.27*1.17±0.22 0.77±0.13△0.79±0.21 1.74±0.36*1.72±0.37 1.18±0.36△0.87±0.24 1.28±0.32*1.27±0.35 1.79±0.38△

3.2 JAK/STAT 信號通路在靜脈移植物狹窄早期炎性反應(yīng)中的作用

JAK/STAT 信號通路是一條將信號從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核的經(jīng)典信號通路，在信號通路中具有代表性，通過受體與酪氨酸激酶結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子與轉(zhuǎn)錄活化因子并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動靶基因表達(dá)途徑發(fā)揮功能，為大多數(shù)細(xì)胞因子共用。 對機(jī)體多種細(xì)胞的增殖和凋亡、神經(jīng)和胚胎發(fā)育以及免疫反應(yīng)發(fā)揮復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控作用[11-12]。 JAK/STAT 家族包括4 個JAK和7 個STAT 成員，研究表明，其中JAK2/STAT3是調(diào)控VSMC 表型轉(zhuǎn)換及遷移增殖的一條重要信號通路[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，術(shù)后1 周內(nèi)的移植靜脈中STAT3 及P-STAT3 表達(dá)明顯上調(diào)。 說明在靜脈移植物狹窄的早期炎性反應(yīng)中， 存在STAT3 的過度激活及其磷酸化，JAK2/STAT3 信號通路發(fā)揮了重要作用。

3.3 SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中的調(diào)節(jié)作用

SOCS 蛋白既是轉(zhuǎn)錄子STAT 的靶基因，反過來，表達(dá)的SOCS 蛋白通過與STAT 競爭結(jié)合停泊位點(diǎn)又抑制其激活及磷酸化， 因此SOCS 是JAK/STAT 信號通路的經(jīng)典負(fù)反饋抑制劑，在細(xì)胞因子表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)平衡作用。 SOCS 家族包括CIS和SOCS1-7 蛋白， 分別由8 個不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)生成，其中SOCS3 是目前研究最多、功能最清楚和作用最強(qiáng)的成員。SOCS3 N 末端的激酶抑制區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)AK2 的激酶區(qū)具有相對更高的親和力[13]，而SOCS3對激活STAT3 的受體又具有特異性更高的結(jié)合力，所以，SOCS3 對JAK2/STAT3 信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)有相對更高的特異性。 SOCS3 通過負(fù)反饋抑制JAK2/STAT3 信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的激活及其絲氨酸和酪氨酸磷酸化， 從而阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，在精細(xì)平衡免疫應(yīng)答進(jìn)程和調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，SOCS3 甲基化基因沉默或表達(dá)上調(diào)在多種炎癥相關(guān)性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[14-17]。 在人動脈粥樣斑塊中的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中檢測到SOCS3 表達(dá)上調(diào)，在ApoE-/-小鼠動物模型中也得到相同結(jié)果。利用腺病毒載體SOCS3基因轉(zhuǎn)染等基因操控技術(shù)誘導(dǎo)其過表達(dá)可抑制單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及VSMC 的分化增殖及合成分泌炎癥細(xì)胞因子。 相反， 應(yīng)用寡核苷酸探針技術(shù)下調(diào)SOCS3 表達(dá)可加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)程，加重動脈硬化程度[10]。 在肝炎和肝癌患者的肝細(xì)胞中檢測到SOCS3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平下調(diào)， 同時存在STAT3 表達(dá)上調(diào)。 通過肝細(xì)胞SOCS3 條件性基因敲除或甲基化基因沉默可加使小鼠肝癌的進(jìn)展加速和程度加重，相反，利用腺病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)SOCS3 過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的分化增殖及生長[18-20]。 SOCS3 基因敲除小鼠在胚胎期死亡。 造血干細(xì)胞SOCS3 基因條件性敲除小鼠會在成年期表現(xiàn)出心臟、肝臟、腎臟及肺等多個重要器官嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)而死亡[14]。 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）存在Th17/Treg 細(xì)胞平衡失調(diào)及Th17 細(xì)胞極化、高表達(dá)MHCⅡ類分子和CD86，體外誘導(dǎo)DC 細(xì)胞過表達(dá)SOCS3 后再過繼性輸注到野生型小鼠后顯著抑制EAE 的進(jìn)程和病變程度[16]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中存在SOCS3 表達(dá)上調(diào)，但仍不足以抑制過度激活的JAK2/STAT3 信號通路。 體外通過攜帶大鼠SOCS3 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMC，誘導(dǎo)其過表達(dá)SOCS3，明顯下調(diào)STAT3、PSTAT3 及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)， 說明SOCS3 通過抑制STAT3 的激活及進(jìn)一步磷酸化可能在靜脈移植物再狹窄病變過程中發(fā)揮有益的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。 那么， 利用基因操控技術(shù)誘導(dǎo)體內(nèi)移植靜脈過表達(dá)SOCS3 能否阻斷或減慢靜脈移植物再狹窄的進(jìn)程，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之， 本實(shí)驗(yàn)研究表明SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中可能發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可為防治靜脈移植物再狹窄提供一種新思路，采取措施啟動炎性反應(yīng)的內(nèi)源性生理性負(fù)向調(diào)節(jié)子SOCS3 的功能可能是治療靜脈移植物再狹窄的一種新策略。

[1] Sabik JF，Lytle BW，Blackstone EH，et al. Comparison of saphenous vein and internal thoracic artery graft patency by coronary system[J].Ann Thorac Surg，2005，79（2）：544-551.

[2] Kim FY，Marhefka G，Ruggiero NJ，et al. Saphenous vein graft disease：review of pathophysiology，prevention，and treatment [J]. Cardiol Rev，2013，21（2）：101-109.

[3] Muto A，Model L，Ziegler K et al. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation：insights into the neointimal algorithm and management strategies[J].Circ J，2010，74（8）：1501-1512.

[4] Mitra AK，Gangahar DM，Agrawal DK. Cellular，molecular and immunological mechanisms in the pathophysiology of vein graft intimal hyperplasia[J].Immunol Cell Biol，2006，84（2）：115-124.

[5] Yoshimura A，Naka T，Kubo M.SOCS proteins，cytokine signalling and immune regulation[J].Nature Reviews Immunology，2007，7（6）：454-465.

[6] Banes AK，Shaw SM，Tawfik A，et al.Activation of the JAK/STAT pathway in vascular smooth muscle by serotonin [J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（4）：C805-C812.

[7] Sasaki A，Yasukawa H，Suzuki A，et al. Cytokine-inducible SH2 protein-3（CIS3/SOCS3）inhibits Janus tyrosine kinase by binding through the N-terminal kinase inhibitory region as well as SH2 domain [J]. Genes Cells，1999，4（6）：339-351.

[8] Hiwatashi K，Tamiya T，Hasegawa E，et al. Suppression of SOCS3 in macrophages prevents cancer metastasis by modifying macrophage phase and MCP2/CCL8 induction [J].Cancer Lett，2011，308（2）：172-180.

[9] Liu X，Qu X，Chen Y，et al. Mesenchymal stem/stromal cells ind uce the generation of novel IL-10-dependent regulatory dendritic cells by SOCS3 activation [J]. J Immunol，2012，189（3）：1182-1192.

[10] Ortiz-Munoz G，Martin-Ventura JL，Hernandez-Vargas P，et al. Suppressors of cytokine signaling modulate JAK/STAT-mediated cell responses during atherosclerosis [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（4）：525-531.

[11] O'Sullivan LA，Liongue C，Lewis RS，et al. Cytokine receptor signaling through the Jak-Stat-Socs pathway in disease [J]. Mol Immunol，2007，44（10）：2497-2506.

[12] Darnell JE.STATs and gene regulation[J].Science，1997，277（5332）：1630-1635.

[13] Naka T，Narazaki M，Hirata M，et al. Structure and function of a new STAT-induced STAT inhibitor [J]. Nature，1997，387（6636）：924-929.

[14] Croker BA，Metcalf D，Robb L，et al. SOCS3 is a critical physiological negative regulator of G-CSF signaling and emergency granulopoiesis[J].Immunity，2004，20（2）：153-165.

[15] Wong PK，Egan PJ，Croker BA，et al.SOCS-3 negatively regulates innate and adaptive immune mechanisms in acute IL-1-dependent inflammatory arthritis [J]. J Clin Invest，2006，116（6）：1571-1581.

[16] Li Y，Chu N，Rostami A，et al. Dendritic cells transduced with SOCS-3 exhibit a tolerogenic/DC2 phenotype that directs type 2 Th cell differentiation in vitro and in vivo[J]. J Immunol，2006，177（3）：1679-1688.

[17] Asari A，Kanemitsu T，Kurihara H. Oral administration of high molecular weight hyaluronan（900 kDa）controls immune system via Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium[J].J Biol Chem，2010，285（32）：24751-24758.

[18] Ogata H，Kobayashi T，Chinen T，et al.Deletion of the SOCS3 gene in liver parenchymal cells promotes hepatitis-induced hepatocarcinogenesis [J]. Gastroenterology，2006，131（1）：179-193.

[19] Niwa Y，Kanda H，Shikauchi Y，et al. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma [J]. Oncogene，2005，24（42）：6406-6417.

[20] Cui Q，Jiang W，Wang Y，et al.Transfer of suppressor of cytokine signaling 3 by an oncolytic adenovirus induces potential antitumor activities in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2008，47（1）：105-112.