免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法檢測(cè)中藥材中赭曲霉毒素A

李 浩

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021)

赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中最主要的一種，在紫外光下顯綠色熒光，屬于穩(wěn)定的無(wú)色結(jié)晶化合物，呈弱酸性，溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水，溶點(diǎn)為165 ℃[1-2]。目前，已知赭曲霉毒素A 能致癌、致畸、破壞免疫系統(tǒng)，對(duì)腎臟造成損害，還可導(dǎo)致神經(jīng)中毒[3]。世界上許多國(guó)家和涉及安全衛(wèi)生的國(guó)際組織已制訂了對(duì)赭曲霉毒素A 的限制性法律法規(guī)或限量標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。中藥材在生長(zhǎng)、收獲、運(yùn)輸、貯藏、加工等過(guò)程中均有被霉菌污染的可能性，我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中赭曲霉毒素A 的檢測(cè)方法為薄層色譜(TLC)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。免疫親和柱是20 世紀(jì)90 年代在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用的新技術(shù)，溶液樣品的大分子通過(guò)與親和柱體內(nèi)的特異蛋白結(jié)合，得到純度較高的特異性結(jié)合蛋白，再用合適的洗脫液將特異性結(jié)合蛋白洗脫出來(lái)，從而達(dá)到分離、純化的目的，由于該過(guò)程去掉了絕大部分干擾物，故大大提高了信噪比和方法的檢出限。對(duì)于含有多種干擾物質(zhì)的中藥材，如何減少干擾是準(zhǔn)確測(cè)定赭曲霉毒素A 最重要的前提，為此，筆者進(jìn)行了試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Ochra TestTM免疫親和柱(美國(guó)維康、德國(guó)拜發(fā)公司);Waters2695型液相色譜儀、Waters 2475 型熒光檢測(cè)器;KQ-100DB 型數(shù)控超聲波清洗器超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(Electronic Scale);pH 計(jì)(Mettler Toledo);高質(zhì)量空氣泵(Hailea Aco-5502)。赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品(Alexis 公司);乙腈、甲醇均為Fisher Scientific 色譜純;試驗(yàn)用水均為超純水(Milli-Q Academic 0.22 μm 超純水機(jī));磷酸鹽緩沖液(PBS，16 g 氯化鈉+2.4 g 磷酸氫二鈉+0.4 g 磷酸二氫鉀+0.4 g 氯化鉀，用990 mL 水溶解，再用濃HCL 調(diào)pH 至6.8，水稀釋至1 000 mL);洗脫液為5%吐溫(吐溫∶水=5 ∶95);提取液為80%甲醇;稀釋液為吐溫20 ∶PBS(5 ∶95)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm);柱溫:35 ℃;樣品溫度:10 ℃;流動(dòng)相:乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0);流速:1 mL/min;檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)333 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)示裝量為1.0 mg)，精密稱(chēng)定0.99 mg，分次用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為貯備液(約100 μg /mL)。精密量取貯備液1 mL，用乙腈稀釋至含赭曲霉毒素A 約為1 000，10，2 ng/mL 的對(duì)照品溶液。取供試品粉末約5 g，精密稱(chēng)定，加入2 ～3 g 氯化鈉，精密加入80%甲醇溶液50 mL，超聲10 min，玻璃濾紙濾過(guò)，精密量取濾液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加含5%吐溫20 的pH=6.8 PBS 稀釋至刻度，搖勻，玻璃濾紙濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，過(guò)赭曲霉免疫親合柱，流速為1 mL/min，用水20 mL 分2 次洗柱，洗液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，精密量取甲醇1.0 mL 分2 次洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，收集洗脫液，用甲醇定容至1 mL，即得供試品溶液。

2.3 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算供試品中赭曲霉毒素A的含量。以外標(biāo)法定量、保留時(shí)間定性、峰面積定量，樣品中赭曲霉毒素A 含量按以下公式計(jì)算，X(ng/g)=(Ai× Cs× V)/(As×m)。式中，X 為樣品中含量(ng/g)，Ai為樣品溶液赭曲霉毒素A的峰面積，As為對(duì)照品溶液赭曲霉毒素A 的峰面積，Cs為對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(ng/mL)，V 為稀釋體積，m 為樣品質(zhì)量(g)。

2.4 方法學(xué)考察

最低檢出限測(cè)定:取赭曲霉毒素A 對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為1.98 ng/mL)進(jìn)樣，根據(jù)信噪比S/ N=3 為檢出限，S/ N=10 為定量限，以赭曲霉毒素A 計(jì)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

線(xiàn)性關(guān)系考察:取對(duì)照品溶液(10 ng/mL)分別進(jìn)樣5，10，20 μL，赭曲霉毒素A 對(duì)照品溶液(40 ng/mL)分別進(jìn)樣5，10，20μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、赭曲霉素A 的絕對(duì)量(X，ng)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=3051457X-87602，r=0.9996(n=3)。結(jié)果表明，進(jìn)樣量在50 ～800pg 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 最低檢出限測(cè)定結(jié)果

精密度試驗(yàn):將1.98 ng/mL 的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次20 μL，以赭曲霉毒素A 峰的峰面積值計(jì)算。結(jié)果的RSD 為0.7%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品5 份，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD 為3.7%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):選擇易染赭曲霉毒素同時(shí)代表不同類(lèi)型的中藥材，測(cè)定樣品的赭曲霉殘留量。取白術(shù)樣品進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，添加以赭曲霉毒素A 計(jì)分別為高(40.0 ng/g)、中(25.0 ng/g)、低(2.5 ng/g)3 個(gè)質(zhì)量濃度。分別取樣品5 g，各加入對(duì)照品溶液(赭曲霉毒素A 含量為1 000 ng/mL)200，125，12.5 μL，分別加80%甲醇溶液至50 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。取未檢出赭曲霉毒素A 的補(bǔ)骨脂樣品5 份，分別加1 000 ng/mL 的赭曲霉毒素A 對(duì)照品溶液125 μL，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

表2 白術(shù)加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=3)

表3 補(bǔ)骨脂加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.5 樣品含量測(cè)定

按擬訂方法測(cè)定白花蛇舌草、百合、白術(shù)、白芷(2 批)、柏子仁(2 批)、薄荷、補(bǔ)骨脂(2 批)等樣品中赭曲霉毒素A 的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg/kg)

3 討論

流動(dòng)相選擇:選擇乙腈-水時(shí)，赭曲霉毒素A 峰峰形不尖銳且變形，考慮是赭曲霉毒素A 的解離問(wèn)題;選擇乙腈-水-冰醋酸時(shí)峰形良好;選擇甲醇-水-冰醋酸峰形不穩(wěn)定，甚至不出峰;選擇甲醇-水時(shí)赭曲霉毒素A 不出峰或峰形極差。因此，本試驗(yàn)中采用乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0)為流動(dòng)相。

供試品溶液前處理優(yōu)化:由于考察的中藥材中有一部分含有大量的脂肪類(lèi)、油類(lèi)，這些物質(zhì)會(huì)吸附其他顆粒使之成團(tuán)，從而把赭曲霉毒素包裹住，無(wú)法與免疫親和柱的特異蛋白充分結(jié)合，為了使提取效率、回收效果更好，操作更合理，分別使用高速均質(zhì)器和大功率超聲機(jī)對(duì)樣品溶液進(jìn)行提取回收試驗(yàn)，先加入80%甲醇后，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以防最后加入80%甲醇而使中藥材粉末成團(tuán)而將標(biāo)準(zhǔn)品溶液中赭曲霉毒素A 吸附進(jìn)去，造成回收率下降。經(jīng)多次回收比較發(fā)現(xiàn)，多數(shù)中藥材使用高速均質(zhì)器和超聲提取的回收率均較高且相差不大，而含油脂類(lèi)較豐富的少數(shù)中藥材以使用超聲機(jī)時(shí)回收率更高，故使用超聲機(jī)提取更能廣泛應(yīng)用于中藥材的赭曲霉毒素A 檢測(cè)。赭曲霉毒素A 溶于非極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)多次篩選，發(fā)現(xiàn)甲醇-水(80 ∶20)作為提取溶劑時(shí)提取效果最好，加標(biāo)回收率在74.6%以上。由于赭曲霉毒素A 在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿溶液中易被破壞，經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液pH 為5.6 ～7.1 時(shí)赭曲霉毒素A 回收率較高，通過(guò)篩選pH 相差較大的中藥材進(jìn)行回收試驗(yàn)，最后得出結(jié)論，當(dāng)加入pH=6.8 的PBS 時(shí)，可將補(bǔ)骨脂提取溶液pH 由2.696 調(diào)至5.601，此時(shí)的回收率均能達(dá)到84%以上。

凈化條件選擇:OchraTest 免疫親和柱的優(yōu)點(diǎn)是具有高度的特異性，使用時(shí)不需要活化，但上樣時(shí)有機(jī)溶劑的含量應(yīng)嚴(yán)格控制，甲醇和乙腈等有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)不能超過(guò)20%，否則會(huì)破壞柱體基質(zhì)，影響?hù)髑苟舅谹 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。試驗(yàn)中將80%甲醇稀釋了5 倍，使其濃度降為16%，然后才過(guò)免疫親和柱，最后用純甲醇將赭曲霉毒素A 抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)破壞，使赭曲霉毒素A 脫落流出。

洗脫液選擇:試驗(yàn)多次對(duì)比使用甲醇、乙腈洗脫后的回收效果，發(fā)現(xiàn)使用甲醇的回收率與乙腈相差很小，且甲醇比乙腈便宜，對(duì)試驗(yàn)人員的毒副作用較小，故選用甲醇作為赭曲霉毒素A 的洗脫液。

中藥材中赭曲霉毒素A 添加范圍為2 ～50 ng/g 時(shí)，加樣回收試驗(yàn)的回收率為64.4% ～106.0%，RSD 為0 ～28.5%。該方法簡(jiǎn)單可行，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于中藥材中赭曲霉毒素A 的檢測(cè)。

本研究中的免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定中藥材中的赭曲霉毒素A，方法簡(jiǎn)單可行，結(jié)果準(zhǔn)確，可為我國(guó)一直空缺的中藥材赭曲霉毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供快速、準(zhǔn)確的定性定量檢測(cè)方法。本方法的適用范圍和檢測(cè)低限基本滿(mǎn)足《食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的限量要求，也可滿(mǎn)足出入境檢驗(yàn)檢疫、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督、工商管理、疾病預(yù)防等政府實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量把關(guān)對(duì)赭曲霉毒素A 的檢測(cè)需要。

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