紫地榆兩種不同溶劑萃取物對(duì)變異鏈球菌的體外實(shí)驗(yàn)

楊 淋， 藍(lán) 海

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

紫地榆兩種不同溶劑萃取物對(duì)變異鏈球菌的體外實(shí)驗(yàn)

楊 淋， 藍(lán) 海*

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的研究紫地榆粗提物乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及黏附的影響。方法首先測(cè)定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌最低抑菌濃度 （MIC），選擇大于MIC的濃度測(cè)定其對(duì)變異鏈球菌最低殺菌濃度 （MBC），再以低于MIC的4個(gè)濃度配制含藥的TPY液體培養(yǎng)基測(cè)定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸、黏附的影響。結(jié)果紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及黏附有一定的抑制作用。結(jié)論上述結(jié)果提示，紫地榆有可能是一種潛在的天然防齲藥物，值得進(jìn)行更深入的研究。

紫地榆；萃取物；變異鏈球菌；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度；產(chǎn)酸；黏附

齲病是人類繼心血管疾病和癌癥之后的第三種需要重點(diǎn)防治的疾病，全球60%～90%的兒童和成人都因齲病而困擾。2010年，全球有超過(guò)50億的人患過(guò)齲病［1］。目前，我國(guó)的齲病發(fā)病率高達(dá)70%～80%，在嬰幼兒中高達(dá)90%以上，齲病防治工作迫在眉睫。變異鏈球菌是口腔中的主要常駐菌之一，是齲病的主要致病菌，已被公認(rèn)為口腔的主要致齲菌［2］。本研究探討紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及黏附的影響，為了解該藥物在齲病防治中的作用提供參考。

1 材料

紫地榆 （產(chǎn)地云南，大理大學(xué)生藥教研室楊月娥高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為紫地榆），變異鏈球菌ATCC 25175（廣東微生物菌種保藏中心），胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（trypticase-phytone-yeast extract medium，TPY）固體及液體培養(yǎng)基，0.5、0.1 mo1/L氫氧化鈉，0.5 mo1/L磷酸鹽 （PBS）緩沖液，蔗糖，無(wú)水乙醇，葡萄糖，蒽酮，石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇。以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 紫地榆粗提物的制備 將原藥材粉碎，用95%乙醇常溫浸泡24 h，把濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏后加適量蒸餾水溶解，用石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，蒸餾水萃取，所得的各部分冷凍干燥后得粉末備用。石油醚部分的相對(duì)生藥得率很小 （小于0.1%），三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分的相對(duì)生藥得率分別為0.192 7%～0.308 4%、8.017 2%～9.456 9%、9.048 1%～11.323 3%、2.341 1%～3.198 3%。

2.2 菌液制備 將復(fù)蘇48 h后的變異鏈球菌，接種于TPY液體培養(yǎng)基中，在37℃、80%N2，20%CO2、厭氧條件下培養(yǎng)18 h。經(jīng)生化鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，將細(xì)菌在TPY固體培養(yǎng)基上傳代，用無(wú)菌棉簽取TPY固體培養(yǎng)基上的二代菌落于無(wú)菌生理鹽水內(nèi)，將菌液調(diào)至相當(dāng)于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度，配成630 nm波長(zhǎng)處菌液濃度光密度值（optica1 density，OD值）約為0.1的菌懸液，備用。

2.3 MIC及MBC的測(cè)定 將紫地榆乙酸乙酯部分和水部分分別按2倍稀釋法溶于含1%葡萄糖的TPY液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度分別為72.00、36.00、18.00、9.00、4.500、2.250、1.125、0.563 0 mg/mL。將菌懸液與含藥液的培養(yǎng)基按1∶1（V/V）比例，加入96孔板后置37℃，80%N2，20%CO2厭氧條件下培養(yǎng)48 h，以肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度為其MIC值。選擇大于MIC濃度的各孔，分別取20μL涂布于TPY固體培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌落數(shù)少于5～6個(gè)的最低濃度為最低殺菌濃度 （MBC）［3］，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響 根據(jù)紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)上述變異鏈球菌的MIC測(cè)定結(jié)果，選取MIC值以下4個(gè)濃度梯度配制成含1%葡萄糖的TPY液體培養(yǎng)基，調(diào)定初始pH為7.4并按菌液與TPY液體培養(yǎng)基比例為1∶10（V/V）比例接種此菌，置37℃，80%N2，20%CO2下厭氧培養(yǎng)48 h。用ORION 710A型pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物上清液的pH值計(jì)算pH的變化值△pH（初始pH-終末pH）。以不含藥物的培養(yǎng)基中細(xì)菌的產(chǎn)酸量作為陰性對(duì)照，以含0.05%洗必泰的培養(yǎng)基中細(xì)菌的產(chǎn)酸量作為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)共分6組，即4個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組、1個(gè)陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌黏附作用的影響 采用2倍稀釋法將含5%蔗糖和含紫地榆乙酸乙酯部分、水部分的TPY液體培養(yǎng)基配成MIC以下4個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)1個(gè)不含藥液的陰性對(duì)照組，一個(gè)含0.05%洗必泰的陽(yáng)性對(duì)照，每組3個(gè)平行管。將菌懸液與藥液按體積比1∶10接種，各試管混勻，置管與地平面呈30°，置37℃，80%N2，20%CO2下厭氧培養(yǎng)48 h。將試管中液體輕輕移去，將黏附到試管壁的細(xì)菌用磷酸鹽緩沖液洗脫，每次3 mL，共計(jì)3次，然后3 000 r/min離心20 m in，收集細(xì)菌置于2 mL蒸餾水中混勻。各試管均吸取200μL于96孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處OD值，重復(fù)測(cè)3次，結(jié)果取平均值，并計(jì)算黏附抑制率。

黏附抑制率=（陰性對(duì)照組OD630nm-實(shí)驗(yàn)組OD630nm）/陰性對(duì)照組OD630nm×100%

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)變量資料用 （）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，各組總體均數(shù)之間比較采用單因素方差分析（ANOV，Ana1ysis of variance）；兩兩比較用Dunnett T3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響 紫地榆乙酸乙酯部分對(duì)變異鏈球菌的MIC和MBC分別為4.500 mg/mL，72.00 mg/mL。

紫地榆水部分對(duì)變異鏈球菌的MIC和MBC分別為18.00 mg/mL，288.0 mg/mL。

3.2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響見表1和圖1。

隨著紫地榆乙酸乙酯部分質(zhì)量濃度的升高，△pH值越來(lái)越小。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=3290.116，P＜0.01），經(jīng)Dunnett T3檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組的△pH值與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）；4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間，任意兩組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。

隨紫地榆水部分質(zhì)量濃度的增加，△pH值的變化不明顯。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=3501.803，P＜0.01），經(jīng)Dunnett T3檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)的△pH值與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）；4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間，任意兩組間均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P≥0.05）。

表1 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響 （，n=9）

表1 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響 （，n=9）

注：與陰性照組比較，aP＜0.05；與陽(yáng)性照組比較，bP＜0.05；任意兩實(shí)驗(yàn)組比較，cP＜0.05

乙酸乙酯部分水部分質(zhì)量濃度/（mg·m L-1） △pH值 質(zhì)量濃度/（mg·mL-1） △pH值2.250 0.866 4±0.028 8a，b，c 9.00 0.640 6±0.036 9a，b0.731 7±0.081 6 1.125 0.971 7±0.032 9a，b，c 4.500 0.6403±0.049 1a，b0.563 0 2.635 8±0.280 7a，b，c 2.250 0.666 4±0.057 6a，b0.281 0 3.263 6±0.175 6a，b，c 1.125 0.681 4±0.073 1a，b陰性對(duì)照組 3.549 4±0.045 2 陰性對(duì)照組 2.629 7±0.147 8陽(yáng)性對(duì)照組 0.745 1±0.075 2 陽(yáng)性對(duì)照組

圖1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

3.3 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌黏附作用的影響 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變形鏈球菌黏附的影響見圖2和表2。

隨著紫地榆乙酸乙酯部分質(zhì)量濃度的升高，黏附抑制率也隨之增高。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=342.213，P＜0.01），經(jīng)Dunnett T3檢驗(yàn)，各濃度組OD值與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）；4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間，除0.563 0 mg/m L與0.281 0 mg/mL比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他任意兩組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。

隨著紫地榆水部分質(zhì)量濃度的升高，黏附抑制率也隨之增高。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=754.271，P＜0.01），經(jīng)Dunnett T3檢驗(yàn)，各濃度組OD值與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間，除9.00 mg/mL與4.500 mg/mL比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其他任意兩組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。

圖2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物對(duì)變異鏈球菌黏附的影響

表2 不同質(zhì)量濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌黏附作用的影響（，n=9）

表2 不同質(zhì)量濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)變異鏈球菌黏附作用的影響（，n=9）

注：與陰性照組比較，aP＜0.05；與陽(yáng)性照組比較，bP＜0.05；任意兩實(shí)驗(yàn)組比較，cP＜0.05

水部分質(zhì)量濃度/（mg·mL-1） OD值 黏附抑制率/% 質(zhì)量濃度/（mg·mL-1） OD值 黏附抑制率/% 2.250 0.195 7±0.060 9a，b，c 64.98 9.00 0.277 4±0.022 8a，b乙酸乙酯部分0.043 4±0.004 5 92.23 62.23 1.125 0.246 3±0.039 6a，b，c 55.93 4.500 0.293 3±0.033 8a，b 59.95 0.563 0 0.286 3±0.044 0a，b 48.96 2.250 0.354 1±0.068 6a，b，c 51.60 0.2810 0.317 4±0.034 9a，b 43.20 1.125 0.491 5±0.056 4a，b，c 33.09陰性對(duì)照組 0.558 8±0.060 0 - 陰性對(duì)照組 0.736 9±0.048 3 -陽(yáng)性對(duì)照組 0.043 4±0.004 5 92.23 陽(yáng)性對(duì)照組

4 討論

紫地榆是櫳牛兒苗科老鸛草屬植物Geranium trictipes R.Kunth的根，民間稱隔山消。具有顯著的消炎、止血、止痢功能，用于腸炎，痢疾，消化不良，慢性胃炎，月經(jīng)不調(diào)，鼻衄；外用治跌打損傷［4-6］。張嫻文［7］、 洪小鳳［8］等通過(guò)紫地榆的體外抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)紫地榆提取物具有良好的體外抗菌作用，其主要的化學(xué)成分有［9-10］：沒(méi)食子酸、鞣花酸、原兒茶酸、五倍子酸甲酯、（+）-兒茶素、3，4-二羥基苯甲酸等。

變異鏈球菌的致齲毒力因子主要是對(duì)牙面的產(chǎn)酸、黏附、生成水不溶性胞外多糖。在成熟菌斑深層的缺氧環(huán)境中變異鏈球菌主要通過(guò)糖酵解途徑分解糖而代謝產(chǎn)酸，從而使局部pH下降，造成牙體硬組織酸蝕脫礦、有機(jī)物分解，進(jìn)而導(dǎo)致齲病的形成和發(fā)展［11］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定紫地榆乙酸乙酯部分與變異鏈球菌共同培養(yǎng)48 h后的pH變化發(fā)現(xiàn)，0.563 0～2.250 mg/mL不同質(zhì)量濃度的紫地榆乙酸乙酯部分和1.125～9.00 mg/mL不同質(zhì)量濃度的紫地榆水部分對(duì)變異鏈球菌培養(yǎng)上清液的pH下降均具有明顯影響 （P＜0.05），提示紫地榆乙酸乙酯部分和水部分能抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸。

變異鏈球菌在牙面上黏附和定植是齲病發(fā)生的始動(dòng)因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.563 0～2.250 mg/mL不同質(zhì)量濃度的紫地榆乙酸乙酯部分和1.125～9.00 mg/mL不同質(zhì)量濃度的紫地榆水部分均能明顯抑制變異鏈球菌的黏附能力（P＜0.05）；且其抑制作用隨著紫地榆乙酸乙酯部分質(zhì)量濃度和紫地榆水部分質(zhì)量濃度的增加而明顯增強(qiáng)，提示紫地榆乙酸乙酯部分和水部分能有效抑制變異鏈球菌的黏附能力。本實(shí)驗(yàn)所示的變異鏈球菌的產(chǎn)酸量和黏附率均是用OD值約為1的同一菌懸液實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。變異鏈球菌的產(chǎn)酸量和黏附率與紫地榆萃取物抑制或殺傷變異鏈球菌的菌量呈負(fù)相關(guān)，即藥物質(zhì)量濃度越高，抑制或殺傷變異鏈球菌的菌量越多，故其產(chǎn)酸量和黏附率越低。

醋酸洗必泰又稱醋酸氯己定（ch1orhexidine acetate，CA）是陽(yáng)離子表面活性劑，對(duì)細(xì)菌有良好的親和力，能結(jié)合到細(xì)菌的細(xì)胞膜表面，改變膜的滲透性，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出、細(xì)胞漿沉淀和凝集，從而殺滅細(xì)胞。劉建寧等［12］研究證實(shí)，洗必泰漱口液可以有效地控制菌斑，減輕牙齦炎的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫地榆水部分抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸的能力比0.05%的洗必泰強(qiáng)，且具有顯著性差異（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸的能力比0.05%的洗必泰弱，且顯著性差異較明顯 （P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分和水部分抑制變異鏈球菌黏附的能力均比0.05%的洗必泰弱，可能因?yàn)?.05%的洗必泰抗菌作用強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)細(xì)菌被殺死。天然植物的抑菌作用可能不及化學(xué)試劑洗必泰，但長(zhǎng)期使用洗必泰會(huì)有牙齒變色、味覺(jué)障礙等副作用，因此本研究為尋找副作用較輕的天然防齲藥物打下基礎(chǔ)。

綜上所述，紫地榆乙酸乙酯部分和水部分可抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸、黏附的作用，具有抗菌斑、預(yù)防齲病的潛力。本研究為紫地榆乙酸乙酯部分在口腔防齲方面的應(yīng)用做出初步探索，而其藥物有效成分、防齲具體機(jī)制的研究還有待于進(jìn)一步深入。

致謝:大理大學(xué)病原微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供支持！

［1］Smith D J.Denta1 caries vaccines：Prospects and concerns［J］.Expert Rev Vaccines，2010，9（1）：1-3.

［2］劉 正.口腔生物學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：9-10.

［3］周學(xué)東，肖曉蓉.口腔微生物［M］.成都：四川大學(xué)出版社，2002：386.

［4］國(guó)家中醫(yī)藥管理局 《中華本草》編委會(huì).中華本草：第4卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：728-729.

［5］云南省衛(wèi)生局革命委員會(huì).云南中草藥［M］.昆明：云南人民出版社，1971：796.

［6］黎光南.云南中藥志：第1卷［M］.昆明：云南科技出版社，1990：508-509.

［7］張嫻文，李鳳賢，王 晶.隔山消的抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2009，31（6）：940-942.

［8］洪小鳳，王 濤，施貴榮，等.隔山消不同極性提取物抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2011，33（6）：1052-1054.

［9］藍(lán) 海，李龍星，楊永壽.隔山消的化學(xué)成分研究［J］.大理醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，10（4）：13-14.

［10］楊國(guó)紅，陳道峰.紫地榆的化學(xué)成分及其抗艾滋病病毒活性［J］.中草藥，2007，38（3）：352-354.

［11］李蓓蕾，岳陽(yáng)麗，劉 瑤，等.芹菜素對(duì)變異鏈球菌致齲力影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014，27（7）：377-380.

［12］劉建寧，柯賢俊.洗必泰漱口液及口腔護(hù)理在牙齦炎中的應(yīng)用［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2014，18（12）：162-164.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1843-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.048

2014-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金 （81260512）；云南省大理學(xué)院應(yīng)用開發(fā)研究基金 （Kyyy201102）

楊 淋（1991—），女，碩士。Te1：15125258945，E-mai1：862376190@qq.com

*通信作者：藍(lán) 海 （1964—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物防齲研究。Te1：13769225179，E-mai1：1anhai8696@ 126.com