北京典型景觀水體好氧反硝化菌組成特征

駱堅(jiān)平， 劉玉娟， 潘 濤， 李安峰*

(1.北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，北京 100037；2.國家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

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北京典型景觀水體好氧反硝化菌組成特征

駱堅(jiān)平1,2， 劉玉娟1,2， 潘 濤1,2， 李安峰1,2*

(1.北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，北京 100037；2.國家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

好氧反硝化菌對環(huán)境水體氮素的循環(huán)起到非常重要的作用。對北京市6個(gè)典型景觀水體中好氧反硝化菌進(jìn)行富集培養(yǎng)和分離，并開展菌株的16S rRNA基因測序和組成特征分析。結(jié)果表明，從6個(gè)水體中共富集分離得到80株好氧反硝化菌，均為變形菌門 (Proteobacteria)，聚類于其3個(gè)綱(α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria)，分屬于9個(gè)屬，31個(gè)物種。其中90%左右的菌株具有良好的好氧反硝化能力，是水體進(jìn)行生物脫氮修復(fù)的重要微生物基礎(chǔ)。在不同景觀水體中，好氧反硝化菌表現(xiàn)出較為明顯的分布差異性和性能差異性，除了普遍存在的假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)外，每個(gè)水體基本都有屬于自己的特異菌屬，其中重要的特異菌屬包括Alishewanella、Delftia、Hydrogenophaga和Rheinheimera，這對水體修復(fù)具有指導(dǎo)意義。

景觀水體；好氧反硝化菌；組成特征

景觀水體已成為我國城市規(guī)劃建設(shè)的重要內(nèi)容，但其水質(zhì)現(xiàn)狀卻不容樂觀，富營養(yǎng)化問題已嚴(yán)重影響了城市形象、居民生活和水生態(tài)系統(tǒng)安全。由于景觀水體溶解氧一般維持在較高的水平，氮素污染又是水體富營養(yǎng)化的主要原因之一，因此如何在好氧的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)水體生態(tài)系統(tǒng)中氮素的轉(zhuǎn)化與去除將是景觀水體水質(zhì)原位修復(fù)和保持的重要內(nèi)容。好氧反硝化菌可在有氧條件下利用周質(zhì)硝酸鹽還原酶等好氧反硝化酶進(jìn)行脫氮反應(yīng)[1]，對環(huán)境水體的氮素循環(huán)以及水質(zhì)的改善和保持具有非常關(guān)鍵的作用[2-4]。近年來，好氧反硝化菌對微污染水源、養(yǎng)殖水和地下水等水體修復(fù)的作用已逐步被發(fā)現(xiàn)[5-6]。目前已確認(rèn)的好氧反硝化微生物大多可歸為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、紅球菌屬(Rhodococcus) 等[7]。由于不同的水體具有特定的微生物群落結(jié)構(gòu)以及相互之間的協(xié)同機(jī)制，因此，進(jìn)行特定景觀水體好氧反硝化菌的鑒定和群落組成分析，對如何利用氮循環(huán)微生物強(qiáng)化水體生物脫氮效果具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。目前國內(nèi)外關(guān)于環(huán)境水體好氧反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)調(diào)研和研究鮮有報(bào)道，本研究以北京市典型景觀水體為研究對象，通過富集培養(yǎng)、分離與鑒定、分析和評價(jià)水體中好氧反硝化菌的組成特點(diǎn)及其脫氮性能，以期為我國景觀水體的生態(tài)修復(fù)和保持提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)所需水樣取自北京市6個(gè)公園景觀水體，分別為紫竹院、頤和園、動(dòng)物園、陶然亭、大觀園和朝陽公園，采樣瓶滅菌處理，采集約0.5 m處水樣，采集完成后暫存于冰盒，所有水樣當(dāng)天處理完成。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①溴百里酚藍(lán)(BTB)分離培養(yǎng)基：瓊脂20，KNO31，KH2PO41， FeC12·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉8.5，BTB (1%，溶解于無水乙醇)1 mL/L，pH 7.0； ②TB富集培養(yǎng)基：KNO31，KH2PO41，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1，檸檬酸鈉4.2，pH 7.0；③DM反硝化培養(yǎng)基：KNO31，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉4.5，pH 7.0。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器TaqDNA聚合酶(上海生工)；細(xì)菌通用PCR引物由華大基因合成；小型臺(tái)式高速離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司；氣浴搖床購自金壇市科析儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.2 好氧反硝化菌馴化及富集 在實(shí)驗(yàn)室無菌操作條件下，取10 mL景觀水體樣品，加入至90 mL滅菌TB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，160 r/min 轉(zhuǎn)速的氣浴搖床進(jìn)行好氧反硝化菌的富集培養(yǎng)16 h，然后取10 mL菌液轉(zhuǎn)接至新鮮90 mL滅菌TB液體培養(yǎng)基，定時(shí)測定培養(yǎng)液中總氮濃度。

1.2.3 菌株的分離、純化及保藏 當(dāng)培養(yǎng)液中總氮去除率達(dá)到80%以上時(shí)，取富集液依次稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9六個(gè)梯度，取100 μL至BTB分離培養(yǎng)基，涂布，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。挑取培養(yǎng)基周圍出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的單菌落至BTB培養(yǎng)基，劃線純化，斜面培養(yǎng)基4 ℃保藏。

1.2.5 DNA的提取及PCR擴(kuò)增 基因組DNA通過Chelex法提取，通用引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性99 ℃ 4 min；變性95 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min(共30個(gè)循環(huán))；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至華大基因進(jìn)行16S rRNA基因序列測定。

1.2.6 好氧反硝化菌株分析 將16S rRNA基因序列(約700 bp)導(dǎo)入EzTaxon-e[9]進(jìn)行Blast比對，調(diào)取每條序列最相近菌株16S rRNA基因序列，通過軟件包CLUSTAL_X[10]進(jìn)行比對分析，應(yīng)用MEGA 5[11]軟件，采用鄰位相接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行菌株的系統(tǒng)發(fā)育及組成分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 景觀水體水質(zhì)表征

6個(gè)水體的水樣pH均在7.2±0.2，其他各項(xiàng)指標(biāo)見表1，大觀園水體溶解氧最低，為4.1 mg/L，所有水體都屬于好氧水體。其中，頤和園和動(dòng)物園水體COD和氮濃度均較低，水質(zhì)相對較好，水體中微生物的生長、增殖和正常的新陳代謝功能會(huì)受到一定的抑制；大觀園、朝陽公園和陶然亭公園水體有機(jī)物濃度相對較高，相對有利于微生物的代謝活動(dòng)；除朝陽公園水體碳氮比(COD/TN)達(dá)到2.1外，其余水體碳氮比均小于1，其中頤和園、動(dòng)物園和紫竹院的碳氮比均小于0.3。

2.2 菌株鑒定和分析

本研究從6個(gè)景觀水體中共獲得80株好氧反硝化菌，經(jīng)16S rRNA基因部分序列比對分析，以98%作為區(qū)分原核生物物種的界限[12]，合并相似性在98%以上的菌株為同一物種，共獲得31條不同序列(31條序列的GenBank序列登錄號(hào)為KM219985～KM220014和KJ734677)，即31個(gè)物種，分屬于9個(gè)屬，3個(gè)綱，1個(gè)門，序列的Blast比對結(jié)果見表2，分布特點(diǎn)見表3。

表1 景觀水體水質(zhì)情況(mg/L)

表2 景觀水體好氧反硝化菌物種的16S rRNA 基因序列Blast比對結(jié)果

對每條序列選取1～2條最相似序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖1所示，獲得菌株都屬于變形菌門(Proteobacteria)，聚類于其中的3個(gè)綱：α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria。目前的研究結(jié)果表明，好氧反硝化菌主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)3個(gè)門級(jí)分類單元[13]，變形菌門作為一類形態(tài)和功能多樣性十分豐富的類群，包含了大多數(shù)的好氧反硝化菌。

表3 不同景觀水體好氧反硝化菌屬與種分布特點(diǎn)

圖1 北京市典型景觀水體好氧反硝化菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of aerobic denitrifiers from landscape water bodies

α-Proteobacteria綱中共發(fā)現(xiàn)4株好氧反硝化菌，包含了2個(gè)屬，4個(gè)物種。其中根瘤菌屬(Rhizobium)是一類在厭氧條件下可同時(shí)進(jìn)行固氮作用和反硝化作用的細(xì)菌[14]，而本研究中發(fā)現(xiàn)的該屬菌株可在好氧條件下進(jìn)行反硝化作用，黃廷林在水源水水庫沉積物的篩查中也發(fā)現(xiàn)了此菌屬[15]；此外，Gemmobacter屬在水體中較常見[16]，但是，目前為止作者還未查到有關(guān)此菌屬好氧反硝化能力的研究報(bào)道。β-Proteobacteria亞群中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)菌株，分布于3個(gè)屬，4個(gè)物種。其中，代爾夫特菌屬(Delftia)于2007年從SBR系統(tǒng)中得到分離和鑒定[17]；而嗜酸菌屬(Acidovorax)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)是活性污泥系統(tǒng)廣泛存在的脫氮類群，在污水脫氮中發(fā)揮著重要作用[18]。γ-Proteobacteria亞群中包含了其余72個(gè)菌株，分布于4個(gè)屬，23個(gè)物種，為優(yōu)勢類群。其中，僅假單胞菌屬(Pseudomonas)包含了17個(gè)物種，為該類群的優(yōu)勢屬級(jí)類群，在景觀水體中普遍存在，對水體的脫氮起到十分重要的作用[3,19]，而施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)作為經(jīng)典的好氧反硝化菌株，在本研究中也有發(fā)現(xiàn)；不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)菌株廣泛存在于污水處理活性污泥系統(tǒng)中，可在好氧條件下同時(shí)進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用，對同步硝化反硝化具有重要意義[20]；而Alishewanella屬和Rheinheimera屬目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道它們的好氧反硝化作用。

2.3 景觀水體好氧反硝化菌比較

不同景觀水體的好氧反硝化菌的組成存在較大差異，如表3所示。其中，紫竹院和陶然亭水體包含了最為豐富的物種，而在屬級(jí)多樣性方面大觀園和朝陽公園的種類更為豐富，而且包含Gemmobacter屬和Rheinheimera屬等不常見的好氧反硝化類群；而水質(zhì)較好的頤和園和動(dòng)物園水體中好氧反硝化菌組成相對比較單一。Pseudomonas屬普遍存在于各個(gè)水體，Acinetobacter屬分布也較廣，存在于除紫竹院和大觀園之外的其他4個(gè)景觀水體。同時(shí)，幾乎每個(gè)水體都有自己的特異類群，如頤和園、陶然亭、大觀園、朝陽公園水體各自特異的屬級(jí)類群分別為Alishewanella屬、Delftia屬、Hydrogenophaga屬和Rheinheimera屬。這種好氧反硝化菌的組成差異可能與微生物本身的適應(yīng)性以及水質(zhì)、水體遷移、地理環(huán)境等環(huán)境條件密切相關(guān)，對景觀水體水質(zhì)的微生物修復(fù)和保持具有指導(dǎo)意義。

2.4 菌株好氧反硝化性能評價(jià)

由圖2可以看出，本研究獲得菌株都具備好氧反硝化功能，總氮去除率在30%～50%、50%～70%、70%～90%、90%以上的菌株數(shù)目分別為3、5、17、55株，所占比例分別為3.75%、6.25%、21.25%、68.75%。菌株的好氧反硝化活性與水體COD濃度及碳氮比存在密切的關(guān)系，從COD濃度較低(低碳氮比)的頤和園、動(dòng)物園和紫竹院3個(gè)水體中獲得菌株的脫氮能力明顯要低于其他3個(gè)水體的相同菌株(表1)，以Pseudomonaspeli為例，從動(dòng)物園和紫竹院得到的菌株的總氮去除率一般在60%～70%，而從陶然亭、大觀園和朝陽公園得到的該菌株的去除率均在90%以上。因此，不考慮其他外部條件，在好氧反硝化菌的凈化作用下，水體碳氮比將逐步減少(表1)。研究還發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌往往還具有異養(yǎng)硝化的能力，將硝化和反硝化功能集成于同一菌株，有利于整體脫氮性能的發(fā)揮[19,21]，與此同時(shí)，在實(shí)際水體中，多種好氧反硝化菌之間的協(xié)同作用可以進(jìn)一步提高整體的脫氮能力[22-23]。由此可見，這種好氧反硝化菌的普遍存在性、可調(diào)節(jié)性和高效性為景觀水體水質(zhì)的強(qiáng)化修復(fù)和保持提供了重要的保障。

圖2 景觀水體好氧反硝化菌株脫氮性能評價(jià)Fig.2 Denitrification evaluation of aerobic denitrifiers from landscape water bodies

3 討 論

所調(diào)研的北京市景觀水體TN都大于5 mg/L，碳氮比多在1以內(nèi)，水體中好氧反硝化菌多樣性較為豐富，分屬于9個(gè)屬、31個(gè)物種，并且多數(shù)菌株具有良好的好氧反硝化能力，這對此類水體進(jìn)行強(qiáng)化生物脫氮修復(fù)提供了重要的微生物基礎(chǔ)。不同景觀水體好氧反硝化類群的組成表現(xiàn)出明顯的差異性，除普遍存在的假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)外，不同景觀水體大多存在特異性的好氧反硝化菌群。

水體中COD(碳源)對好氧反硝化菌的活性具有重要的影響，在好氧反硝化微生物的作用下，水體水質(zhì)更容易出現(xiàn)低碳氮比的現(xiàn)象。因此，開展景觀水體的氮素控制和微生物修復(fù)時(shí)，為充分發(fā)揮微生物的脫氮修復(fù)能力，深入分析特定水體的水質(zhì)和好氧反硝化菌群組成特點(diǎn)是非常必要的。當(dāng)然，景觀水體作為一個(gè)動(dòng)態(tài)水生生態(tài)系統(tǒng)，除了好氧反硝化菌外，還有其他細(xì)菌、真菌、菌膠團(tuán)、藻類、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物以及蠕蟲、昆蟲的幼蟲等組成生物，它們與好氧反硝化菌之間的作用也是一個(gè)值得研究的內(nèi)容。

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Composition Characteristics of Aerobic Denitrification Bacteria in Typical Landscape Waters in Beijing

LUO Jian-ping1, 2, LIU Yu-juan1, 2, PAN Tao1, 2, LI An-feng1, 2

(1.BeijingMuni.Res.Inst.ofEnvironm’lProtect.,Beijing100037;
2.Nat’lEngin.Res.Ctr.forUrbanEnvironm’lPollut’nCtrl.,Beijing100037)

Aerobic denitrification bacteria play an important role in nitrogen cycle of waters. In this study, aerobic denitrification bacteria were enriched and separated by domesticated cultivation and selection from 6 typical landscape waters in Beijing, and their 16S rRNA genes were sequenced for bacteria identification. Eighty strains of aerobic denitrifiers were obtained. The results showed that they belong to 9 genera and 31 species, all of them spread in the phylum of Proteobacteria and mainly its three classes: α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, and γ-Proteobacteria. About 90% of the denitrifiers have good denitrification ability, and this is the important microbiological basis for bioremediation of waters. The aerobic denitrifiers showed obvious differences of distribution and denitrification ability in the 6 waters. Although the genusPseudomonasandAcinetobacterwildly distribute among different waters, almost every waters has its own specific genera that includeAlishewanella,Delftia,HydrogenophagaandRheinheimera. Therefore, this is of important guiding significance for waters bioremediation.

landscape waters; denitrification bacteria; composition characteristics

水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07203-001-01);北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院科技基金(2013-A-07)

駱堅(jiān)平 男，副研究員，博士。主要從事廢水深度處理和水體修復(fù)研究和應(yīng)用。Tel：010-68351776，E-mail:luo0409@163.com

* 通訊作者。男，研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗廴究刂?。Tel：010-88380895, E-mail：cee1219@hotmail.com

2014-10-22；

2015-01-04

Q939.11+1；X172

A

1005-7021(2015)06-0021-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.004