LPS 對5 -FU 殺傷QBC939 細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

霍勝軍 呂忠誠 鄒曉鶴 宋建文 王 康

化療是目前惡性腫瘤的治療中不可缺少的一種治療手段，但癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性卻是臨床治療中較為棘手的問題。研究表明，CXCR4 在膽管癌中有表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，CXCR4 基因的抑制劑LPS 可以抑制CXCR4 蛋白的表達(dá)，從而抑制膽管癌細(xì)胞株QBC939 的增殖，誘導(dǎo)凋亡，抑制其侵襲能力試驗(yàn)［1，2］。對白血病、乳腺癌等的研究表明，CXCR4 基因的單克隆抗體通過中和CXCR4 基因，可以增強(qiáng)化療藥物的敏感度，LPS 易于獲得，價(jià)格相對便宜，是否具有此功能，目前尚無研究。本研究應(yīng)用LPS 與5 -FU 共同作用于QBC939 細(xì)胞后，通過MTT 法及流式細(xì)胞法來觀察膽管癌細(xì)胞成活率及凋亡率的變化，觀察LPS 對化療的影響。

材料與方法

1.材料:人永生化膽管癌細(xì)胞系QBC939，由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科中心王曙光等建株。胰蛋白酶:購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。新生小牛血清購自天津?yàn)笊锕こ逃邢薰尽ｄ寤谆邕蚨剿牡?MTT)購自美國AMRESLO 公司。二甲基亞砜(DMSO)購自北京鼎國生物工程有限公司。

2.試驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):人膽管癌細(xì)胞株QBC939，用含10% 小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化傳代。(2)試驗(yàn)分組:取對數(shù)生長的QBC939 細(xì)胞，分為對照組及試驗(yàn)組，對照組加等量培養(yǎng)液，試驗(yàn)組分為兩組，試驗(yàn)1 組加5 -FU(濃度為1μg/ml)，試驗(yàn)2 組加5 -FU +LPS，5 -FU 濃度相同，LPS劑量采用1μg/ml。觀察QBC939 細(xì)胞生長狀況良好，加到96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)1 ×104，按組加入藥物，每孔總體積為0.2ml，每孔設(shè)3 個復(fù)孔，共接種7 板。(3)MTT 比色法繪制細(xì)胞生長曲線:每日取出1 板，棄去培養(yǎng)液，生理鹽水漂洗1 遍，每孔加入20μl 的MTT，濃度為5mg/ml;繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾盡上清;每孔加入二甲基亞砜0.1ml 搖床上搖動約15min 以充分溶解;用酶標(biāo)儀在波長540nm 處檢測各孔光密度值(A 值)。然后以A 值為縱坐標(biāo)時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。(4)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×(105～106)ml，3 組細(xì)胞常規(guī)條件下培養(yǎng)72h 后，1000r/min 離心5min PBS 洗滌，重復(fù)3 次，70%乙醇固定后上機(jī)。采用Beckon/Dickinson Facssort 型流式細(xì)胞儀，在488nm 波長處進(jìn)行檢測，測量的數(shù)據(jù)和圖片送入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用相應(yīng)程序軟件進(jìn)行資料的處理和分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)及單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MTT 檢測LPS 對5 -FU 化療效果的影響:從各組細(xì)胞的生長曲線可以看出，對照組細(xì)胞移植處于增殖中，試驗(yàn)1 組(5 -FU 組)和2 組(5 -FU +LPS組)生長趨勢一致，前2 天A540 值均明顯下降，但自第3 天開始，試驗(yàn)1 組A540 值停止下降，第4 天A540 值出現(xiàn)緩慢上升，而試驗(yàn)2 組卻持續(xù)下降，至第7 天，兩組細(xì)胞的A540 值出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)，提示5 -FU 對膽管癌細(xì)胞株QBC939 殺傷作用明顯，但易出現(xiàn)耐藥性，而加用LPS 后，能一定程度上防止耐藥的出現(xiàn)(圖1，表1)。

圖1 各組1 周生長曲線圖

2.流式細(xì)胞儀檢測LPS 對5 -FU 誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞凋亡的影響:化療藥物5 - FU 能顯著誘導(dǎo)QBC939 細(xì)胞發(fā)生凋亡，未加藥前凋亡指數(shù)為3.53 ±0.32，而加化療藥物5 -FU 后，凋亡指數(shù)為11.5 ±2.15，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，同時(shí)合用LPS 后，能更明顯的誘導(dǎo)凋亡，凋亡指數(shù)達(dá)到26.5 ±3.12，與單用加化療藥物5 -FU 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，表2)。

表1 第7 天兩試驗(yàn)組OD 值比較

表2 LPS 對5 -FU 誘導(dǎo)QBC939 細(xì)胞凋亡的影響

討 論

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是化療失敗的主要原因。其耐藥機(jī)制有多種解釋，主要是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，包括P -糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白等，腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的缺陷也是MDR 其中的機(jī)制之一，不同腫瘤細(xì)胞對化療敏感度的差異，主要是各種腫瘤細(xì)胞對凋亡的閾值不同。對細(xì)胞凋亡機(jī)制的修復(fù)可增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感度，克服耐藥性的產(chǎn)生，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增強(qiáng)化療藥物的敏感度成為近年來腫瘤治療的重要策略。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，5 -FU 對膽管癌殺傷作用明顯，但3 天后即出現(xiàn)明顯的耐藥。有研究顯示，單用LPS 對膽管癌細(xì)胞株QBC939 的增殖有抑制作用，但沒有殺傷作用:1.0μg/ml 濃度的LPS 與細(xì)胞共培養(yǎng)72h，OD 值為0.329 ±0.108，較對照組細(xì)胞0.552 ±0.142 的OD 值低，但較同濃度LPS 與細(xì)胞共培養(yǎng)24h 時(shí)的OD 值0.229 ±0.074 增高，說明細(xì)胞有增殖，而LPS 與5 -FU 合用對膽管癌細(xì)胞株QBC939 的殺傷作用明顯而且持續(xù)，從MTT 法繪制出的生長曲線可以看出，合用LPS 雖然不能加強(qiáng)早期5 -FU 對膽管癌細(xì)胞株QBC939 的殺傷效應(yīng)，但可以有效防止耐藥性的產(chǎn)生，1 周后，合用LPS 殺傷作用明顯強(qiáng)于不用者，單用5 -FU 組 的OD 值為0.125 ±0.013，5 -FU+LPS組的OD 值為0.059 ±0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［2］。結(jié)合流式細(xì)胞結(jié)果看，LPS 有效的防止5 -FU 對膽管癌細(xì)胞株QBC939 耐藥性的產(chǎn)生可能與LPS 能更明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。SDF-1/CXCR4 基因在很多腫瘤中有表達(dá)，而對白血病的研究表明，抑制白血病細(xì)胞表面的CXCR4 基因表達(dá)，也能很好的增強(qiáng)化療藥物對白血病細(xì)胞后期的殺傷作用，本試驗(yàn)結(jié)果與此一致［3～6］。說明CXCR4 基因的過表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制。而應(yīng)用LPS 后，能明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)化療藥物5 -FU對膽管癌細(xì)胞株QBC939 的后期殺傷作用，在膽管癌的治療中，LPS 能發(fā)揮積極作用。

趨化因子及其受體是近年腫瘤研究的熱點(diǎn)，CXCR4 基因及其配體SDF -1 在多種腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［4］。雖然其機(jī)制尚未完全清楚，但針對這一基因組的抗腫瘤治療已經(jīng)在一些試驗(yàn)研究中得到證實(shí)，本試驗(yàn)表明，LPS 不僅能抑制膽管癌細(xì)胞株QBC939 的增殖與侵襲能力，也能很明顯的增強(qiáng)化療藥物的作用。

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