復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡中JNK/Bax信號通路的影響

周凌云， 鐘 玉， 張玉笛， 李榮亨

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶400016）

復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡中JNK/Bax信號通路的影響

周凌云， 鐘 玉， 張玉笛， 李榮亨*

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶400016）

目的探討復(fù)元膠囊對實(shí)驗性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡影響的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人軟骨肉瘤細(xì)胞（SW1353），給予白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）刺激，復(fù)元膠囊含藥血清和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的特異抑制劑SP600125干預(yù)，隨機(jī)分為正常組、模型組、抑制劑組、復(fù)元膠囊組、復(fù)元膠囊+抑制劑組，流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞周期百分率和細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法 （Western blot）檢測細(xì)胞信號因子磷酸化c-Jun氨基末端活化蛋白激酶（p-JNK）和Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果IL-1β誘導(dǎo)SW1353后，模型組G1期的百分比增加，S期及G2期的百分比減少，細(xì)胞凋亡率顯著增高 （P＜0.01）；抑制劑組、復(fù)元膠囊組和復(fù)元膠囊+抑制劑組G1期的百分比減少，S期及G2期的百分比增加，細(xì)胞凋亡率顯著降低，p-JNK和Bax表達(dá)明顯減少 （P＜0.05或P＜0.01），其中以復(fù)元膠囊+抑制劑組的各項指標(biāo)變化最顯著 （與模型組比較，P＜0.01）。結(jié)論復(fù)元膠囊可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中p-JNK及下游信號因子Bax的活化和表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)增殖，可用于防治骨關(guān)節(jié)炎。

復(fù)元膠囊；骨關(guān)節(jié)炎；JNK；Bax；凋亡

關(guān)節(jié)軟骨退行性病變是骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明［1］，隨著年齡增長，軟骨細(xì)胞凋亡增加，其數(shù)量與骨關(guān)節(jié)炎呈正相關(guān)。復(fù)元膠囊是治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)益肝腎、益氣活血之功效，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗采用流式細(xì)胞儀和蛋白質(zhì)印跡法觀察復(fù)元膠囊含藥血清對IL-1β誘導(dǎo)的體外SW 1353細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其防治骨關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗材料

1.1 主要儀器 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；超凈工作臺（日本Airtech公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；流式細(xì)胞儀（美國Bekman Coulter公司）；常溫高速離心機(jī)、冷凍高速離心機(jī) （長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；低溫冰箱 （青島海爾股份有限公司）；電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥物與試劑 復(fù)元膠囊為自制 （重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號090312）；重組人白介素-1β（美國PeproTech公司）；JNK特異抑制劑SP600125（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；一抗4668P Phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）、2772s Bax Antibody（美國CST公司）；二抗ABLP1001A HRP羊抗兔IgG（美國Abgent公司）；內(nèi)參Anti GAPDH pAb（南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動物與細(xì)胞 新西蘭大白兔3只，體質(zhì)量（1.9±0.1）kg，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（渝）2012-0001；人軟骨肉瘤細(xì)胞 （SW1353），購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 實(shí)驗方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 在37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素（PS）的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SW1353，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞長滿80%后，開始傳代培養(yǎng)。

2.2 含藥血清的制備 新西蘭大白兔3只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，體質(zhì)量 （1.9+0.1）kg，隨機(jī)分為給藥組和對照組。給藥組2只，體質(zhì)量分別為1.8和1.9 kg；對照組1只，體質(zhì)量2.0 kg。給藥組按Meeh-Rubner公式灌胃給予等效劑量10倍量的藥物 （之前充分溶于生理鹽水）；對照組灌胃給予等劑量的生理鹽水，每日2次，連續(xù)5 d。末次灌胃2 h后，兔頸總動脈插管取血，4℃下過夜，3 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22μm濾器除菌，分裝備用，-20℃下貯藏。

2.3 實(shí)驗分組 將細(xì)胞以1.5×106個/mL的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后用復(fù)元膠囊最佳含藥血清濃度 （15%）［2］和SP600125干預(yù)細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗，待穩(wěn)定1 h后，再加入IL-1β（10 ng/mL）刺激細(xì)胞。然后，分為正常組（15%空白血清+DMEM培養(yǎng)基）、模型組 （10 ng/m L IL-1β+15%空白血清+DMEM培養(yǎng)基）、抑制劑組（10 ng/mL IL-1β+SP600125+15%空白血清+DMEM培養(yǎng)基）、復(fù)元膠囊組（10 ng/mL IL-1β+15%含藥血清+DMEM培養(yǎng)基）、復(fù)元膠囊+抑制劑組（10 ng/m L IL-1β+SP600125+15%含藥血清+DMEM培養(yǎng)基）。在37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期 按一定細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞后，無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用于同步化細(xì)胞周期。按實(shí)驗分組加藥處理方法培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，300μL PBS加以重懸，逐滴加入預(yù)冷的無水乙醇700μL，標(biāo)記后將標(biāo)本送往重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院流式細(xì)胞室檢測，實(shí)驗重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡 按一定細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞24 h后，按實(shí)驗分組加藥處理方法培養(yǎng)48 h，收集上清液后標(biāo)記，中和胰酶消化，離心5 min（1 000 r/min），棄上清液，1 mL PBS重懸細(xì)胞，再移至5個EP管中，標(biāo)記后將標(biāo)本送往重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院流式細(xì)胞室檢測，實(shí)驗重復(fù)3次。

2.6 蛋白印跡法檢測細(xì)胞信號因子p-JNK和Bax的蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理方法同前。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分組提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。40μg蛋白/泳道上樣，SDS-PAGE電泳分離條帶，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，封閉，TBS-T洗膜，再加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃下反應(yīng)過夜，洗膜，二抗室溫下孵育1～2 h，洗膜，然后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在BIO-RAD凝膠成像儀下曝光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析每個條帶的灰度值，計算p-JNK/GAPDH、Bax/GAPDH值，重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞周期的影響 與正常組比較，模型組G0/G1期的百分比增加，S期及G2/M期的百分比減少，細(xì)胞增殖指數(shù) （PI）減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，抑制劑組、復(fù)元膠囊組及復(fù)元膠囊+抑制劑組的G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加，PI增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01或P＜0.05），其中復(fù)元膠囊組與復(fù)元膠囊+抑制劑組作用更為明顯 （P＜0.01），且后者的PI大于前者 （P＜0.01），見表1。

表1 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW 1353細(xì)胞周期的影響(x±s)Tab.1 Effects of Fuyuan Capsules on the cell cycle in JL-1 beta induced SW 1353(x±s)

4.2 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞凋亡的影響 與正常組比較，IL-1β誘導(dǎo)模型組的細(xì)胞凋亡率顯著增高 （P＜0.01）；含藥血清及抑制劑干預(yù)后，與模型組比較，抑制劑組、復(fù)元膠囊組、復(fù)元膠囊+抑制劑組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。其中，復(fù)元膠囊組細(xì)胞凋亡率低于抑制劑組，而復(fù)元膠囊+抑制劑組細(xì)胞凋亡率低于復(fù)元膠囊組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

4.3 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW1353細(xì)胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組的p-JNK和Bax蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，干預(yù)組的p-JNK和Bax蛋白表達(dá)均明顯減少 （P＜0.01）；復(fù)元膠囊組與抑制劑組比較，p-JNK的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），Bax的表達(dá)顯著減少 （P＜0.01）；復(fù)元膠囊+抑制劑組與抑制劑組比較，p-JNK的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），而Bax的表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；復(fù)元膠囊+抑制劑組與復(fù)元膠囊組比較，p-JNK和Bax的表達(dá)均顯著減少（P＜0.01），見圖1和表3。

表2 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW 1353細(xì)胞凋亡的影響(x±s)Tab.2 Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis rate in IL-1 beta induced SW 1353

圖1 磷酸化JNK蛋白與Bax蛋白的W estern Blot檢測結(jié)果Fig.1 Results of p-JNK and Bax datected by W estern blot

表3 復(fù)元膠囊對IL-1β誘導(dǎo)的SW 1353細(xì)胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達(dá)的影響 (x±s)Tab.3 E ffects of Fuyuan Capsules on the expression of p-JNK and Bax in IL-1 beta induced SW 1353(x± s)

5 討論

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis）的病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨退變，而軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞［3］，在軟骨形成、代謝以及修復(fù)中起著極其重要的作用。凋亡細(xì)胞如果不能有效地從軟骨中被清除，其產(chǎn)物便可引起病理性的軟骨降解，因此以抗凋亡為靶點(diǎn)的干預(yù)正逐漸成為治療骨關(guān)節(jié)炎的重要方法。骨關(guān)節(jié)炎在祖國醫(yī)學(xué)中屬于 “骨痹”的范疇，氣虛血瘀、肝血不足、腎元虧虛是導(dǎo)致發(fā)病的根本內(nèi)因。本實(shí)驗所用的復(fù)元膠囊中含有黃芪、生曬參、丹參、川芎等藥用于益氣活血化瘀，配以淫羊藿、鹿茸、續(xù)斷、枸杞子等藥用于補(bǔ)益肝腎。前期研究已證實(shí)，復(fù)元膠囊可通過調(diào)節(jié)軟骨中P38［4］、ERK1/2［5］通路，抑制下游相關(guān)凋亡基因如P53、Caspase-3等表達(dá)或活化，減少細(xì)胞凋亡，降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨的退變。

復(fù)元膠囊為口服給藥，其有效物質(zhì)需以血液為介質(zhì)，輸送到靶點(diǎn)來產(chǎn)生作用，因而給藥后的血清才是真正起作用的 “制劑”，并且血清中含有的成分才是藥物在體內(nèi)起直接作用的物質(zhì)［6］。故本實(shí)驗根據(jù)血清藥理學(xué)方法，選用復(fù)元膠囊制成含藥血清，干預(yù)體外培養(yǎng)的SW1353。由于原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)難度大，易去分化，且涉及倫理學(xué)問題，而SW1353與正常人軟骨細(xì)胞相似，具有良好的軟骨細(xì)胞表型和功能，體外長期培養(yǎng)表型穩(wěn)定，故采用SW 1353代替人軟骨細(xì)胞進(jìn)行研究［7］。

IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中起著重要作用，故本實(shí)驗選用IL-1β刺激體外培養(yǎng)細(xì)胞來模擬骨關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境。JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與P38和ERK同是哺乳動物體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的一員［8］。JNK信號通路能被生長因子、細(xì)胞因子 （TNF-α、IL-1）等激活［9］而形成p-JNK，直接調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)靶蛋白的活性（如Bax、Bim等）而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［10］。故本實(shí)驗從復(fù)元膠囊對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及JNK信號通路的角度進(jìn)一步探討其防治骨關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。

細(xì)胞的周期分布能夠反映細(xì)胞增殖的具體過程，PI與S期百分比是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)［11］。本實(shí)驗結(jié)果顯示，用IL-1β刺激SW1353后，細(xì)胞增殖情況減弱，用含藥血清及抑制劑干預(yù)后，PI增加，其中以復(fù)元膠囊組及復(fù)元膠囊+抑制劑組作用最為明顯。由此可知，復(fù)元膠囊能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

在骨關(guān)節(jié)炎病變過程中，軟骨細(xì)胞凋亡率顯著上升［12］。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路被IL-1β激活時，其下游基因Bax表達(dá)同步增加，而應(yīng)用復(fù)元膠囊含藥血清后，p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)和細(xì)胞凋亡率也均明顯下降，提示復(fù)元膠囊能抑制IL-1β誘導(dǎo)的SW1353中p-JNK和Bax的活化和表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)用SP600125阻斷JNK信號通路后，復(fù)元膠囊+抑制劑組與抑制劑組比較，p-JNK表達(dá)無明顯變化，而Bax表達(dá)仍然減少，細(xì)胞凋亡率顯著降低，推測復(fù)元膠囊還可能通過其它信號通路 （如Wnt、NF-κB等）來抑制IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮自身獨(dú)特的多靶點(diǎn)效應(yīng)。關(guān)于復(fù)元膠囊是否通過這幾條通路共同作用或相互作用，則尚需作進(jìn)一步研究。

另外實(shí)驗還表明，復(fù)元膠囊抑制IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是通過抑制p-JNK的活化和表達(dá)，進(jìn)而抑制其信號通路下游凋亡基因Bax的表達(dá)，由此減少細(xì)胞凋亡，同時促進(jìn)其增殖，這可能也是復(fù)元膠囊防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

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Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocyte in JNK/Bax signaling pathway

ZHOU Ling-yun， ZHONG Yu， ZHANG Yu-di， LIRong-heng*
（Department of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate themechanism of Fuyuan Capsules on the inhibition apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocytes.METHODSHuman chondrosarcoma cellswere cultured and divided into five groups randomly：normal group，model group，inhibitor group，F(xiàn)uyuan Capsules group，F(xiàn)uyuan Capsules+inhibitor group.The percentage of cell cycle and apoptosis index were detected by Flow cytometry.The expression of cell signaling factor of p-JNK and Bax were determined by Western blot.RESULTSFuyuan Capsules serum could decrease the percentage of G0/G1phase，but increase the percentage of S phase and G2/M phase in human SW 1353 chondrosarcoma cells IL-1 beta-induced（P＜0.01）.The apoptotic index decreased significantly（P＜0.01）.The levels of p-JNK and Bax were abated significantly（P＜0.01）.CONCLUSIONFuyuan Capsules can decrease the apoptosis index and promote the proliferation associated with p-JNK and Bax in osteoarthritis chondrocyte.Thismay be one of themechanisms about prevention of Fuyuan Capsules in osteoarthritis.

Fuyuan Capsules；osteoarthritis；JNK；Bax；apoptosis

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1422-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.007

2014-12-12

重慶市衛(wèi)生局資助項目 （2008-2-35）

周凌云 （1988—），女，碩士，研究方向為風(fēng)濕病和老年病學(xué)。Tel：15922761851，E-mail：421615271@qq.com

*通信作者：李榮亨 （1945—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治風(fēng)濕病和老年病。Tel：13320337836，E-mail：Lrongheng1231@163.com