桃仁中苦杏仁苷及多糖的閃式提取工藝

吳兆宇， 郝鵬飛， 馮素香*， 劉富崗， 李建生， 李曉玉

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；2.南陽理工學(xué)院，河南南陽473000）

桃仁中苦杏仁苷及多糖的閃式提取工藝

吳兆宇1， 郝鵬飛2， 馮素香1*， 劉富崗1， 李建生， 李曉玉1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；2.南陽理工學(xué)院，河南南陽473000）

目的通過比較閃式提取法和回流提取法對桃仁有效成分的提取效果，選擇較優(yōu)的提取方案。方法以苦杏仁苷的量及轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，進(jìn)行閃式提取正交設(shè)計，正交最優(yōu)結(jié)果與乙醇回流法提取的結(jié)果進(jìn)行對比，并對閃式提取及回流提取苦杏仁苷后的藥渣進(jìn)行回流提取多糖，對其多糖的提取率進(jìn)行比較。結(jié)果閃式提取最優(yōu)工藝提取苦杏仁苷的含有量為2.50 mg/g，轉(zhuǎn)移率為71.48%；回流提取苦杏仁苷的含有量為2.26 mg/g，轉(zhuǎn)移率為64.61%；閃式提取法和回流提取法的藥渣中多糖的出膏率分別為7.32%和5.91%。結(jié)論閃式提取的苦杏仁苷的提取率及藥渣中多糖的出膏率均高于回流提取苦杏仁苷的提取率及藥渣中多糖的出膏率。

閃式提取；回流提取；苦杏仁苷；正交設(shè)計；多糖

桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch或山桃Prusua davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子；性苦、甘，歸心、肝、大腸經(jīng)；有活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘的功能；常用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，肺癰腸癰，跌撲損傷，腸燥便秘，咳嗽氣喘［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，桃仁醇提取物具有抗過氧化作用，可以改善記憶力，延緩衰老［2］；其水提取物能改善寒凝血瘀證和瘀熱互結(jié)證大鼠的血液循環(huán)障礙，對內(nèi)臟有不同的保護(hù)作用［3］及抗皮膚過敏及抗氧化性［4］等功效；桃仁油可顯著降低模型動物的血黏度，增大動靜脈口徑［5］。目前對其苦杏仁苷及多糖等有效成分的提取方法的研究有回流提取法［6］、水酶法［7］、超聲提取法［8］等，但尚未見到用閃式提取法提取桃仁的有效成分，本實驗針對此工藝對其進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 JHBE-50閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（配Waters2998紫外檢測器，Empower色譜工作站）；KH2200DB型超聲波清洗器 （江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2450型紫外可見分光光度計 （日本島津公司）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒儀器有限公司）；SHE-D（III）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 苦杏仁苷 （批號110820-201004），D-無水葡萄糖 （批號110833-200904）均購于中國食品藥品檢定研究院；桃仁藥材購于張仲景大藥房，由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為薔薇科植物桃P.persica（L.）Batsch的干燥成熟種子；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司），磷酸、無水乙醇、丙酮、乙醚 （以上試劑均為分析純），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁苷的測定

2.1.1 色譜條件 Venusil XBP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，博納艾杰爾科技有限公司），以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）為流動相；體積流量1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為207 nm。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計算應(yīng)不低于7 000?？嘈尤受諏φ掌芳肮┰嚻返纳V圖，見圖1。

圖1 對照品（A）和供試品（B）HPLC圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的苦杏仁苷對照品20.10 mg，至50 m L的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，作為對照品貯備液0.402 mg/mL。精密量取配置好的苦杏仁苷對照品溶液0.5、1、2、4、5、10 mL分別置10 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻。精密吸取上述稀釋對照品溶液20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品進(jìn)樣質(zhì)量濃度 （mg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.7× 106X-4.2×105，r=0.999 0。結(jié)果表明苦杏仁苷在0.020 1～0.402 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，記錄峰面積，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為1.18%，表明儀器精密度好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取一份樣品約10 mg，精密稱定，精密加入甲醇5 m L，使完全溶解，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液，分別于配制后的0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定苦杏仁苷的峰面積，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為1.24%，說明供試品溶液在常溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取樣品6份，按 “2.1.4”項下方法處理制得6份供試品溶液，并按 “2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果苦杏仁苷的RSD為1.30%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 取已經(jīng)測定含有量的樣品9份，每份5 mg，精密稱定，隨機(jī)分成3組，每組3份，按照供試品中苦杏仁苷的含有量，以其80%、100%、120%比例精密加入對照品貯備液，揮干甲醇后加入樣品，按“2.1.4”項方法處理并按 “2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 閃式提取方法的考察

2.2.1 閃提電壓的考察 在進(jìn)行正交試驗前，先對其電壓進(jìn)行單因素考察，分別取100 V、120 V、140 V不同水平進(jìn)行試驗。取桃仁藥材，粉碎成粗粉，先用石油醚回流提取1 h，棄石油醚，藥渣分別加入6倍量70%乙醇閃提1次，每次1min，每個試驗組平行做3份，以桃仁中苦杏仁苷的含有量及轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表2 提取電壓的考察 （x±s，n=3）

由表2可見，苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率最高時的電壓為120 V，因此，選用120 V為閃式提取的有效電壓。

2.2.2 苦杏仁苷的閃式提取正交試驗 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比 （B）和提取時間 （C）為考察因素，以提取物中苦杏仁苷的含有量和轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，選擇水平進(jìn)行正交試驗。選桃仁藥材，粉碎，稱取50 g，用石油醚（沸程30～60℃）回流1 h，在120 V電壓下按L9（34）正交表，分別閃式提取2次，合并濾液，回收乙醇，將濾液濃縮至浸膏，后冷凍干燥，得粗提物。取本品粗提物約10 mg，精密稱定，精密加入甲醇5 mL，使完全溶解，過濾，精密量取續(xù)濾液1mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按 “2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表3～5。

表3 因素水平

表4 苦杏仁苷閃式提取工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 方差分析

結(jié)果分析：由表3可知，三個因素的影響大小順序是乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時間，在表4中可知，A因素對苦杏仁苷的含有量和轉(zhuǎn)移率有極顯著的影響（PA＜0.01），且A2＞A3＞A1，故選A2；而因素B和因素C對苦杏仁苷的含有量和轉(zhuǎn)移率無顯著影響，根據(jù)表3的測定結(jié)果顯示，苦杏仁苷的閃提最佳工藝是A2B2C1，即加10倍70%乙醇閃式提取1min。

2.2.3 驗證試驗 為驗證正交設(shè)計實驗中最優(yōu)工藝的重復(fù)性和可靠性，分別取50 g桃仁，用閃提最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，平行操作3份，藥材中苦杏仁苷的含有量分別為2.50、2.49、2.50mg/g，可見其工藝穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.2.4 閃提與乙醇回流提取法對比［9-10］設(shè)計出乙醇回流提取苦杏仁苷的最優(yōu)工藝：70%乙醇回流提取2次，每次30 min，料液比是1∶12（g∶mL），結(jié)果比較見表6。

從表6可知，閃式提取法所用的時間比回流提取法所用的時間短，且閃式提取苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率高于回流提取的轉(zhuǎn)移率，故閃式提取法優(yōu)于傳統(tǒng)的回流提取法。

3 桃仁多糖的提取

3.1 提取工藝［11-12］分別取閃式提取與回流提取后的藥渣，用藥渣質(zhì)量30倍量體積的蒸餾水80℃水浴提取多糖兩次，合并濾液，將濾液濃縮至料液比1∶1.5～1∶2（原料重：溶液體積），加入乙醇使醇體積分?jǐn)?shù)為80%（V/V）進(jìn)行醇沉，在4℃冰箱中靜置12 h，醇沉液離心，下層沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，即得桃仁多糖粗提物。

表6 閃式提取和回流提取的工藝比較（x±s，n=3）

3.2 多糖的測定

3.2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精密稱定干燥至恒定質(zhì)量的無水葡萄糖對照品33.36mg，加至100mL的量瓶中，加水溶解并定容至刻度作為對照品溶液；精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于具塞試管中，加水補(bǔ)足2mL，各精密加入5%苯酚試液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫［1］，以相應(yīng)的試劑做空白，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，顯色時多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=61.103X-0.081 7，r=0.999 0，結(jié)果表明多糖在0.066 72～0.333 6 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 樣品的測定 稱取樣品多糖2 mg，蒸餾水溶解于25mL量瓶中定容搖勻，精密吸取2 mL溶液于具塞試管中，空白對照以蒸餾水代替糖溶液，分別加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出迅速冷卻到室溫，在波長490 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含有量，結(jié)果見表7。

表7 藥渣提取多糖的結(jié)果比較 （x±s，n=3）

結(jié)果分析：閃式提取法提取苦杏仁苷后的藥渣提取多糖，多糖的出膏率高于回流提取法提取后藥渣中多糖的出膏率，可見閃式提取法將藥材粉碎更有利于多糖的提取。

4 討論

4.1 苦杏仁苷提取工藝的比較 通過正交試驗對閃式提取桃仁中苦杏仁苷工藝的優(yōu)化，即12倍量70%的乙醇閃式提取1 min，與乙醇回流對比，結(jié)果顯示閃式提取對藥材有效成分的提取率高，提取時間短，提取效率高，其綠色、環(huán)保、高效、經(jīng)濟(jì)等方面的優(yōu)勢是傳統(tǒng)回流法不能比擬的。4.2 多糖結(jié)果分析 從回流提取法提取多糖的結(jié)果分析，閃式提取苦杏仁苷后的藥渣提取多糖，多糖的出膏率高于回流提取后藥渣提取多糖的出膏率，原因是在閃式提取過程中藥材粒徑更小，從而更有利于有效成分在提取過程中的析出。

閃式提取器的主要原理是在植物組織破壞提取法的基礎(chǔ)上，利用高速機(jī)械外力迅速破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的有效成分與溶劑充分接觸，從而實現(xiàn)有效成分的快速提出［13-14］。通過本實驗可以看出，閃式提取相對傳統(tǒng)的回流提取具有提取率高，節(jié)省時間，操作簡便的特點。然而閃式提取在提取藥材的過程中，藥材粉碎過細(xì)，易出現(xiàn)不易抽濾的現(xiàn)象；并且閃式提取操作時間不能太長，單次不能超過2min。因該方法是室溫提取，具有不易破壞有效成分的特點，因此適應(yīng)于多種有效成分的提取，并且高效節(jié)能，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞崛〖夹g(shù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：232-233.

［2］于兆霞，陳正愛，鐘秀宏，等.桃仁乙醇提取物對亞急性衰老大鼠的抗衰老作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（11）：2607-2608.

［3］以 敏，鄧家剛，郝二偉，等.桃仁提取物對不同病因所致大鼠血液循環(huán)障礙的影響［J］.中草藥，2013，44（7）：858-862.

［4］李 楊，董銀卯，孟 宏，等.7種中草藥提取物抗過敏功效及刺激性研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：191-194.

［5］裴 瑾，顏永剛，萬德光，等.桃仁油對動物血液流變學(xué)及微循環(huán)的影響［J］.中成藥，2011，33（4）：587-589.

［6］許寧俠，陳 邦，申燁華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化長柄扁桃中苦杏仁苷的提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（4）：270-273.

［7］史雙枝，劉憶冬，李 疆，等.水酶法同時提取核桃仁油脂及水解蛋白的工藝研究［J］.中國食品添加劑，2010，15（1）：131-135.

［8］劉 云，劉通訊.桃仁油的超聲波輔助提取及脂肪酸組成分析［J］.食品工業(yè)科技，2010，25（2）：292-294，313.

［9］陳志紅，王莉平，李 敏，等.核桃仁中苦杏仁苷提取工藝的研究［J］.應(yīng)用化工，2010，39（7）：949-951.

［10］鄧康穎，譚曉梅，羅佳波.一種苦杏仁苷提取物的制備方法［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（10）：2172-2174.

［11］王 亮，姜 波，王喜春，等.桃仁中多糖的提取工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：271-272.

［12］謝 霞，李 芝，黃瑋超，等.細(xì)柱五加莖多糖閃式提取工藝優(yōu)化及其免疫活性研究［J］.中草藥，2013，44（20）：2859-2863.

［13］吳冬梅.閃式提取器在中藥研究中的應(yīng)用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2006，12（7）：34-37.

［14］劉延澤.植物組織破碎提取法及閃式提取器的創(chuàng)制與實踐［J］.中國天然藥物，2007，5（6）：401-407.

R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1353-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.045

2014-06-15

吳兆宇（1989—），男，碩士生，從事中藥復(fù)方有效組分配伍研究。Tel：15978438724，E-mail：yz5tcm2014@163.com

*通信作者：馮素香 （1971—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量分析與新藥研究工作。E-mail：fengsx221@163.com