紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

王碧琴 周華 朱祺 劉騰云 余發(fā)新

摘要：以紫山藥的莖尖、莖段為材料，對莖尖、莖段誘導(dǎo)分化不定芽進行初步研究，結(jié)果表明，莖尖、莖段不定芽的分化率隨6-BA濃度的增加而提高，芽苗增殖率先由低到高，再降低；MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基對不定芽有較高的分化率和增殖率；莖尖、莖段培養(yǎng)20d為1個繼代周期，莖段在第2次繼代期、莖尖在第3次繼代周期培養(yǎng)時，不定芽的增殖率最高；不定芽苗2.0～3.0cm時從苗基部或分枝處剪下進行生根誘導(dǎo)，生根率在95%以上。

關(guān)鍵詞：紫山藥；莖尖；莖段；組織培養(yǎng)；不定芽

中圖分類號：S632.104+.3文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0048-03

紫山藥俗稱薯蕷、腳板薯、長芋，為薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea）的一個地方品種，為多年生蔓性植物，塊根呈塊狀或圓柱狀，表皮和肉質(zhì)因呈紫紅色而得名。紫山藥肥大的肉質(zhì)塊根細膩滑爽、口感極佳，富含黏性蛋白、紫色花青素、維生素、膽堿和薯蕷皂（天然的DHEA）等，內(nèi)含各種荷爾蒙基本物質(zhì)，有促進內(nèi)分泌荷爾蒙的合成等多種獨特食療價值，也稱“紫人參”。據(jù)《本草綱目》記載，經(jīng)常食用紫山藥，不僅可以增加人體的抵抗力，降低血壓、血糖，抗衰益壽等，而且還具有固腎、潤肺益精、軟化血管等藥用滋補功能，故又享有“蔬菜之王”的美譽。病毒病是造成山藥產(chǎn)量下降、品質(zhì)退化的重要因素。紫山藥由于長期使用塊莖繁殖，出現(xiàn)病毒積累，種性退化，已危及到產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，不但滿足不了市場需求，還嚴重影響和制約地方產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和種植的積極性。山藥感染的主要病毒有壞死花葉病毒、綠色斑駁病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒[1]，目前尚無有效藥物可控制這些病毒病的發(fā)生或蔓延。采用現(xiàn)代生物技術(shù)，選取優(yōu)良無病株種苗進行離體脫毒培養(yǎng)，以組培苗更替?zhèn)鹘y(tǒng)的營養(yǎng)繁殖可以從根本上解決病毒病的問題。有關(guān)盾葉薯蕷、惠樓山藥、懷山藥等組織培養(yǎng)與快繁的研究[2-5]已見報道，紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究還末見報道。為此，本試驗開展紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以期為紫山藥組培苗工廠化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

紫山藥，由江西萬載輝明有機農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。選擇個大無病蟲、表面根毛少、肉紫色的塊莖，經(jīng)表面消毒，在室（棚）溫15～25℃于盆中沙藏催芽30d左右，待嫩芽生長到20～30cm即可作為外植體取材。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基初始培養(yǎng)基：MS；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA0.1～2.0mg/L+NAA0.1mg/L；生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+Ac0.2g/L。所用培養(yǎng)基均含45g/L食用糖和瓊脂6g/L，pH值為5.8。培養(yǎng)基在121℃、131kPa條件下滅菌25min，備用。

1.2.2外植體消毒去掉展開的葉片，分別剪成帶葉柄的莖段、莖尖；用洗液清洗干凈，在無菌操作臺上用70%乙醇消毒30s，無菌水沖洗數(shù)次；分別用0.1%HgCl2浸泡消毒，莖尖5min、莖段10min，用無菌水沖洗數(shù)次。

1.2.3莖尖和莖段的初始培養(yǎng)莖段帶節(jié)剪成0.8～1.0cm的小段，共72段，莖尖剪留0.5～0.8cm，共30個；分別接種于初始培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計枯死率和成活率。

1.2.4激素濃度對莖尖、莖段的誘導(dǎo)分化初始培養(yǎng)的莖段腋芽抽長2.0cm時，將新抽枝從基部剪下，每莖段0.5cm左右，帶葉柄接種在不同激素濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每處理接種30莖段；初始培養(yǎng)的莖尖修剪基部褐化的部分，取莖尖0.3cm左右，接種在不同激素濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每處理接種12莖尖。莖尖、莖段培養(yǎng)20d，新鮮培養(yǎng)基繼代1次，40d后觀察不定芽變化，并統(tǒng)計誘導(dǎo)分化率、不定芽數(shù)和增殖率。

1.2.5培養(yǎng)周期對莖尖、莖段的誘導(dǎo)分化再生莖尖、莖段（含不同株系紫山藥1#、2#）各30個，接種在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)20d為1個繼代周期，共繼代4次，統(tǒng)計不定芽數(shù)和增殖率。

1.2.6生根培養(yǎng)剪取不定芽苗2.0～3.0cm，接種于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，20d后統(tǒng)計生根數(shù)。

1.3培養(yǎng)條件

接種后的試材，均在溫度（25±2）℃、光照度1200lx、光照時間10h/d條件下培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1莖尖、莖段的初始培養(yǎng)

外植體接種在初始培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3d，基部開始變褐，培養(yǎng)基出現(xiàn)褐化，褐色物滲入培養(yǎng)基呈圓形；培養(yǎng)10～15d，外植體基部褐化加重，部分莖尖變褐、枯死，莖段基部1/3處枯死；培養(yǎng)20d，莖尖枯死率為17%，莖段枯死率為7%，外植體基部的莖節(jié)處腫大，并有淡紅色圓形芽點，莖段葉柄張開，腋芽開始萌動；培養(yǎng)30d左右，莖段葉腋抽生1～2個不定芽，長0.5～2.5cm，稍嫩的莖段葉腋形成0.1～0.2cm小瘤狀物，莖尖、莖段成活率分別為43%和91%。

2.26-BA濃度對莖尖、莖段誘導(dǎo)分化的影響

莖尖0.3cm、莖段0.5cm分別接種在不同6-BA濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5d，莖段切口處分泌褐色物，在培養(yǎng)基中擴散由淺褐至深褐；培養(yǎng)10～15d，莖段基部增粗，葉柄張開，腋芽萌發(fā)單個或多個不定芽小點，單個不定芽伸長，生長較快，不定根長2～4cm，不定芽長2.0cm，隨激素濃度的加大，莖段形成的叢生芽體數(shù)增多，最多可達5～7個，莖尖由于個體小，分化的芽點也小，分化率雖高，但能形成正常的小芽少，隨培養(yǎng)時間的延長，部分小芽可生長成正常芽，但芽體較弱、矮小或畸型；培養(yǎng)20d左右，不定芽基部生長1～3條淡紅色不定根，不定根生長快，可直接伸入培養(yǎng)基分泌酚類化合物，受多酚氧化酶激活產(chǎn)生醌類物質(zhì)，加重培養(yǎng)基褐化程度。由表1可見，6-BA濃度為0.1mg/L時，莖尖、莖段誘導(dǎo)分化率和增殖率均最低，分別為90%、0%和93%、123%；6-BA濃度為1.0mg/L時，莖尖、莖段誘導(dǎo)增殖率均為[KG*5]最高，分別為50%和250%；莖尖和莖段在MS+6-BA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，既能保持一定的分化率又有較好的不定芽增殖率。

2.3培養(yǎng)周期對莖尖、莖段誘導(dǎo)分化的影響

試驗結(jié)果表明，莖段培養(yǎng)15～20d，不定芽由莖段基部葉腋、隱芽分化，或由腋芽直接分化形成不定芽，莖尖僅在葉腋處膨大，露出小小的芽點；培養(yǎng)40d（2次繼代），莖段不定芽長0.5～1.0cm，不定芽增殖數(shù)達到高峰，增殖數(shù)達到42個，后不定芽增殖系數(shù)逐步下降；隨著培養(yǎng)時間延長，不定芽增多，形成多個多芽體（圖1），莖節(jié)處有少量不定根；培養(yǎng)60d（第3次繼代），莖段苗高2.0～4.0cm，基部1～2節(jié)處有多條不定根，并有多芽體叢生現(xiàn)象，基部不定芽分化基本停止，莖稈節(jié)腋處產(chǎn)生重疊多芽體，芽體莖稈細小，不利于作次代增殖材料，莖尖葉腋形成多個不定芽，增殖數(shù)隨培養(yǎng)時間延長不定芽增多，增殖數(shù)由少到高并回落，莖尖培養(yǎng)60d時不定芽增殖數(shù)為最高，增殖數(shù)達到40個（表2）；隨著培養(yǎng)繼代次數(shù)的增加，不定芽增殖數(shù)增加，出現(xiàn)枝上生芽的多芽體現(xiàn)象。

2.4對不同株系莖段誘導(dǎo)分化的影響

紫山藥不同株系從試管苗外觀上進行區(qū)別，1#莖稈粗壯、淡綠色，葉片綠色，2#莖稈稍細、紫色，葉深紫色（圖2、圖3）。在培養(yǎng)過程中，紫山藥1#莖段愈傷組織較松軟，誘導(dǎo)不定芽時間短，需7～10d，產(chǎn)生不定芽2～3個，且生長伸長快，容易形成多芽體現(xiàn)象；紫山藥2#愈傷莖段組織質(zhì)地較硬，誘導(dǎo)不定芽時間長，需15～20d，不定芽為單個生長，伸長慢，芽體小，增殖系數(shù)也少（表3）。紫山藥1#芽體每繼代周期的增殖系數(shù)是紫山藥2#的1.54倍，有利于建立快繁體系。這種不同的誘導(dǎo)分化效果，與材料本身的生理遺傳基因-植物受體多樣性及與內(nèi)源激素的合成和代謝差異有密切關(guān)系[6-9]。

2.5不定芽的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

由圖4可見，在生根培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10d，小苗基部開始著生1～3條白或水紅色細長的根，15d后根在培養(yǎng)基底部長達10cm；小苗葉片大，色質(zhì)光綠，葉柄長，小苗主側(cè)枝伸長，莖節(jié)上不斷有不定根形成。20d后生根率在95%以上，此時，可移出培養(yǎng)室，在自然光下煉苗3～5d，用水洗凈瓊脂，移栽至營養(yǎng)缽。

3小結(jié)

紫山藥外植體接種后由自養(yǎng)變?yōu)楫愷B(yǎng)，細胞代謝發(fā)生變化，產(chǎn)生了一些酚類化合物，這些酚類物質(zhì)受多酚氧化酶激活，被氧化后產(chǎn)生呈粽褐色的醌類物質(zhì)，隨著外植體的傷口或愈傷組織逐步從組織擴散到培養(yǎng)基中，影響外植體器官的分化，嚴重時會使組織死亡。莖尖組織比較幼嫩，抗醌類物質(zhì)毒害較弱，在培養(yǎng)過程中容易褐化死亡。因此，外植體在接種后需釆用7～10d繼代（更換）1次培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基中高濃度激素是加劇外植體褐變的因素。在次生莖段分化增殖培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA濃度為1.0～2.0mg/L時褐化較重，每15d左右就需繼代1次培養(yǎng)基；當(dāng)6-BA0.5mg/L時褐化較輕，一般20～25d更換1次培養(yǎng)基有利于細胞的正常分化。在一定范圍內(nèi)，激素濃度與次生莖段誘導(dǎo)分化率成正比，激素濃度越高，分化的不定芽越多。培養(yǎng)繼代的次數(shù)越多，產(chǎn)生不定芽多芽體也多，尤其在不定芽2次繼代后比較明顯，這與晏嬰才等的研究結(jié)論[2]基本相似。

從不定芽增殖量上看，外植體莖尖誘導(dǎo)分化的不定芽數(shù)量多于莖段。從生物遺傳角度及農(nóng)藝性狀上分析，莖尖誘導(dǎo)分化的不定芽變異性大，對改良品種、選育新品種比較適合，莖段快繁能保持品種的品性，有利于提高品種的優(yōu)良品質(zhì)。因此，在利用組織培養(yǎng)技術(shù)時，應(yīng)根據(jù)需求目的，選擇適合的培養(yǎng)方式來建立無性快繁體系。

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