海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

于紅梅+趙密珍+錢亞明+王靜+夏謹+龐夫花

摘要：以海沃德獼猴桃?guī)а壳o段為外植體直接誘導再生芽，對繼代增殖和生根等培養(yǎng)基進行篩選試驗，建立海沃德獼猴桃組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。結(jié)果表明：75%乙醇30s+0.1%氯化汞8min為最佳消毒方法；誘導再生芽培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；繼代增殖培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，其增殖系數(shù)為3.60；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.7mg/LIBA，生根率達100%，平均生根數(shù)達7.8條。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；帶芽莖段；組織培養(yǎng)；快繁技術(shù)

中圖分類號：S663.404+.3文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0078-02

獼猴桃（Actinidiadelikiosa）是20世紀人工馴化栽培野生果樹最有成就的四大果種之一[1]。海沃德獼猴桃是新西蘭選育的美味獼猴桃優(yōu)良品種，其果肉細嫩、香氣濃郁、口感香甜清爽、具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的藥用價值，被稱為“果中之王”。因其具有味美、耐貯、貨架期長、較好的豐產(chǎn)性等優(yōu)點而深受果農(nóng)和廣大消費者喜愛，從而成為世界主栽品種。目前，獼猴桃的常規(guī)育苗方法主要為實生苗的嫁接法和成年株的扦插繁殖法。嫁接苗童期生長緩慢，育苗周期長達2年以上，而扦插苗成活率低[2]。近年來，我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)效益顯著，栽培面積逐年擴大，傳統(tǒng)育苗方法已不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求，致使良種推廣受到很大的限制。張海平等以其莖尖為外植體，經(jīng)愈傷組織出芽建立快繁體系[2]。吳秀華等以無菌苗的葉片為外植體，采用一步出芽法對不定芽進行誘導、增殖和生根，從而成功建立離體快繁體系[3]。劉長春等以金富獼猴桃?guī)а壳o段為外植體，誘導腋芽萌發(fā)芽，再通過增殖培養(yǎng)和生根建立了快繁體系[4]。隆前進等以紅陽帶芽莖段為外植體進行出芽誘導，通過不定芽增殖和生根成功建立離體快繁體系[5]。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，以海沃德獼猴桃?guī)а壳o段為外植體直接誘導再生芽，對繼代增殖和生根等培養(yǎng)基等進行篩選試驗，建立了海沃德獼猴桃組培快繁技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料的選擇

海沃德獼猴桃幼嫩新梢的帶芽莖段采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所溧水基地，采集時間是2012年4月。

1.2消毒方法

將材料經(jīng)流水沖洗1.5～2.0h，在無菌操凈工作臺上，取1.5cm帶芽莖段先用75%醫(yī)用乙醇消毒30s，接著無菌水沖洗2遍，然后按照以下處理要求分別進行消毒處理：A.0.1%氯化汞6min；B.0.1%氯化汞8min；C.0.1%氯化汞10min；D.10%次氯酸鈉10min；E.10%次氯酸鈉12min；F.10%次氯酸鈉15min；G.10%雙氧水5min；H.10%雙氧水10min；I.10%雙氧水15min，最后每個處理消毒后用無菌水沖洗4～5遍。

1.3篩選誘導再生芽培養(yǎng)基

滅菌后切取1.0cm帶芽莖段，接入添加不同激素6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA濃度（0、0.1、0.2mg/L）組合的MS培養(yǎng)基，共8個處理。MS培養(yǎng)基蔗糖含量為30g/L、瓊脂含量為6.5g/L，pH值為5.8～6.0。每個處理接種帶芽莖段30個，置于溫度（25±2）℃、光照強度約2400lx的條件下光照14～16h/d，15d后統(tǒng)計腋芽萌芽率。

1.4篩選繼代增殖培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素6-BA（0.5、1.0、2.0mg/L）和NAA濃度（0、0.1、0.2mg/L）組合，共9個處理。選取上述腋芽萌發(fā)長勢一致的健壯海沃德獼猴桃再生芽，接入以上9種pH值為5.8～6.0的繼代增殖培養(yǎng)基中，光照條件同“1.3”，培養(yǎng)20d后調(diào)查增殖效果及有效苗情況。

1.5篩選生根培養(yǎng)基

選取長勢一致的健壯海沃德獼猴桃組培苗，接入生根培養(yǎng)基中，共11個處理，不同激素6-BA（0、0.5、0.7、1.0mg/L）和NAA（0、0.1、0.3mg/L）濃度組合配比，其他條件同上。每個處理轉(zhuǎn)接30管，每管1株，培養(yǎng)12d后調(diào)查海沃德獼猴桃苗的生根率和平均生根數(shù)等。平均生根數(shù)=各處理所有根長大于0.5cm根的總數(shù)/30。

1.6煉苗移栽

打開生根試管苗保鮮膜，在室內(nèi)放置1～2d，然后取出洗凈培養(yǎng)基，移栽到配制好的基質(zhì)里（進口泥炭∶珍珠巖∶蛭石的體積比為6∶3∶1），保持濕度90%左右，適當遮陰，保持通風，增加光照，3周后調(diào)查苗的成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑的消毒效果

選用氯化汞、次氯酸鈉、雙氧水3種表面消毒劑分別對海沃德獼猴桃?guī)а壳o段消毒處理不同時間，10d后調(diào)查消毒效果。結(jié)果表明：氯化汞消毒效果明顯比次氯酸鈉、雙氧水好；次氯酸鈉對外植體切口的損害較重，褐化多，雙氧水對外植體消毒不徹底，污染、褐化較嚴重。處理B消毒效果最佳（表1）。

2.26-BA和NAA濃度配比對再生芽誘導的影響

由表2可知，添加NAA的基本培養(yǎng)基都可以萌芽，在0～2.0mg/L6-BA處理下，以1.0mg/L6-BA萌芽率最高，隨6-BA濃度的增大，萌芽率略降低。NAA（0.1～0.2mg/L）處理的萌芽情況取決于6-BA濃度的配比，添加激素的最佳配比為1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，萌芽率達93.33%，其次為2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，萌芽率達86.67%。

2.36-BA和NAA濃度配比對繼代增殖的影響

由表3可見，MS培養(yǎng)基中6-BA濃度為2mg/L的增殖系數(shù)為2.97～3.60，1.0mg/L的增殖系數(shù)為2.73～3.03，0.5mg/L的增殖系數(shù)為2.03～2.67，表明一定濃度范圍內(nèi)，6-BA濃度增加有利于芽的增殖，培養(yǎng)基中含NAA多少與芽增殖無線性關(guān)系，但NAA可促進生長。0.1mg/LNAA+2.0mg/L6-BA為海沃德獼猴桃最適的繼代增殖配比濃度。

2.4不同激素對海沃德獼猴桃生根的影響

選取長勢一致的健壯獼猴桃組培苗，接到不同激素濃度配比1/2MS培養(yǎng)基中進行生根對比，12d后調(diào)查生根情況，結(jié)果見表4。激素濃度配比對再生芽生根率的影響較明顯，IBA濃度相同時，NAA濃度增加對根的伸長有抑制作用，纖細且短。IBA濃度為0.7mg/L時，不添加NAA，生根率達100%，且根粗壯、發(fā)達，平均生根數(shù)多達7.80條。

3小結(jié)

目前，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行組織離體再生培養(yǎng)已在植物的無性繁殖中廣泛應用。培養(yǎng)基中的不同激素濃度配比對獼猴桃誘導愈傷組織、繼代增殖、生根均有很大的影響[6-7]。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上縮小6-BA、NAA和IBA激素的濃度配比梯度，建立海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。嘗試應用海沃德獼猴桃?guī)а壳o段跳過愈傷組織誘導不定芽，直接誘導腋芽萌發(fā)再生芽，植株整齊生長快，其再生芽萌發(fā)率達到100%。在繼代增殖過程中，合理使用6-BA、NAA配比濃度，增殖系數(shù)達到3.60，低于吳秀華等的“海沃德平均繁殖系數(shù)為6.38”的結(jié)果[3]，但本試驗有效苗率達89.26%，提高了再生芽品質(zhì)。在生根過程中，不定根的生根率達100%，明顯高于張海平等的“海沃德獼猴桃中獲得的生根率為90.0%”的結(jié)果[2]，與吳秀華等的海沃德獼猴桃生根率試驗結(jié)果[3]相同。在海沃德獼猴桃移栽時，平均生根數(shù)直接影響組培苗的移栽存活率，張海平等指出選用進口泥炭的成活率達95%，吳秀華等證明普通基質(zhì)移栽成活率92.38%[3]，而本試驗在通氣性較好的進口泥炭、珍珠巖、蛭石混合基質(zhì)中，根系能夠得到良好發(fā)育，移栽成活率達到96.7%，本試驗生根時間縮短至12d，同時跳過愈傷組織誘導不定芽，快繁周期大為縮短，利于生產(chǎn)上規(guī)模化快速繁育種苗。

參考文獻：

[1]Warring，tonIJ，WestonGC.Kiwifruits：scienceandmanagement[M].Auckland：RayRichardsPublisher，1990.

[2]張海平，周建峰，任目瑾.海沃德獼猴桃組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)研究[J].陜西林業(yè)科技，2011（2）：8-11.

[3]吳秀華，張艷玲，周月，等.‘海沃德獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J].植物生理學報2013，49（8）：759-763

[4]劉長春，陳澤雄，龔雪芹，等.金富獼猴桃離體培養(yǎng)與植株再生的優(yōu)化研究[J].西南師范大學學報：自然科學版，2007，32（5）：124-128.

[5]隆前進，吳延軍，謝鳴.‘紅陽獼猴桃葉片和帶芽莖段的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2010（4）：429-432

[6]姜維梅，李鳳玉.大籽獼猴桃離體再生系統(tǒng)的建立[J].浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，200329（3）：295-299.

[7]劉長江，劉國成，趙德英，等.野生軟棗獼猴桃莖尖培養(yǎng)研究[J].中國果樹，2009（2）：32-34.

2.4不同激素對海沃德獼猴桃生根的影響

選取長勢一致的健壯獼猴桃組培苗，接到不同激素濃度配比1/2MS培養(yǎng)基中進行生根對比，12d后調(diào)查生根情況，結(jié)果見表4。激素濃度配比對再生芽生根率的影響較明顯，IBA濃度相同時，NAA濃度增加對根的伸長有抑制作用，纖細且短。IBA濃度為0.7mg/L時，不添加NAA，生根率達100%，且根粗壯、發(fā)達，平均生根數(shù)多達7.80條。

3小結(jié)

目前，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行組織離體再生培養(yǎng)已在植物的無性繁殖中廣泛應用。培養(yǎng)基中的不同激素濃度配比對獼猴桃誘導愈傷組織、繼代增殖、生根均有很大的影響[6-7]。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上縮小6-BA、NAA和IBA激素的濃度配比梯度，建立海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。嘗試應用海沃德獼猴桃?guī)а壳o段跳過愈傷組織誘導不定芽，直接誘導腋芽萌發(fā)再生芽，植株整齊生長快，其再生芽萌發(fā)率達到100%。在繼代增殖過程中，合理使用6-BA、NAA配比濃度，增殖系數(shù)達到3.60，低于吳秀華等的“海沃德平均繁殖系數(shù)為6.38”的結(jié)果[3]，但本試驗有效苗率達89.26%，提高了再生芽品質(zhì)。在生根過程中，不定根的生根率達100%，明顯高于張海平等的“海沃德獼猴桃中獲得的生根率為90.0%”的結(jié)果[2]，與吳秀華等的海沃德獼猴桃生根率試驗結(jié)果[3]相同。在海沃德獼猴桃移栽時，平均生根數(shù)直接影響組培苗的移栽存活率，張海平等指出選用進口泥炭的成活率達95%，吳秀華等證明普通基質(zhì)移栽成活率92.38%[3]，而本試驗在通氣性較好的進口泥炭、珍珠巖、蛭石混合基質(zhì)中，根系能夠得到良好發(fā)育，移栽成活率達到96.7%，本試驗生根時間縮短至12d，同時跳過愈傷組織誘導不定芽，快繁周期大為縮短，利于生產(chǎn)上規(guī)模化快速繁育種苗。

參考文獻：

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[3]吳秀華，張艷玲，周月，等.‘海沃德獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J].植物生理學報2013，49（8）：759-763

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[6]姜維梅，李鳳玉.大籽獼猴桃離體再生系統(tǒng)的建立[J].浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，200329（3）：295-299.

[7]劉長江，劉國成，趙德英，等.野生軟棗獼猴桃莖尖培養(yǎng)研究[J].中國果樹，2009（2）：32-34.

2.4不同激素對海沃德獼猴桃生根的影響

選取長勢一致的健壯獼猴桃組培苗，接到不同激素濃度配比1/2MS培養(yǎng)基中進行生根對比，12d后調(diào)查生根情況，結(jié)果見表4。激素濃度配比對再生芽生根率的影響較明顯，IBA濃度相同時，NAA濃度增加對根的伸長有抑制作用，纖細且短。IBA濃度為0.7mg/L時，不添加NAA，生根率達100%，且根粗壯、發(fā)達，平均生根數(shù)多達7.80條。

3小結(jié)

目前，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行組織離體再生培養(yǎng)已在植物的無性繁殖中廣泛應用。培養(yǎng)基中的不同激素濃度配比對獼猴桃誘導愈傷組織、繼代增殖、生根均有很大的影響[6-7]。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上縮小6-BA、NAA和IBA激素的濃度配比梯度，建立海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。嘗試應用海沃德獼猴桃?guī)а壳o段跳過愈傷組織誘導不定芽，直接誘導腋芽萌發(fā)再生芽，植株整齊生長快，其再生芽萌發(fā)率達到100%。在繼代增殖過程中，合理使用6-BA、NAA配比濃度，增殖系數(shù)達到3.60，低于吳秀華等的“海沃德平均繁殖系數(shù)為6.38”的結(jié)果[3]，但本試驗有效苗率達89.26%，提高了再生芽品質(zhì)。在生根過程中，不定根的生根率達100%，明顯高于張海平等的“海沃德獼猴桃中獲得的生根率為90.0%”的結(jié)果[2]，與吳秀華等的海沃德獼猴桃生根率試驗結(jié)果[3]相同。在海沃德獼猴桃移栽時，平均生根數(shù)直接影響組培苗的移栽存活率，張海平等指出選用進口泥炭的成活率達95%，吳秀華等證明普通基質(zhì)移栽成活率92.38%[3]，而本試驗在通氣性較好的進口泥炭、珍珠巖、蛭石混合基質(zhì)中，根系能夠得到良好發(fā)育，移栽成活率達到96.7%，本試驗生根時間縮短至12d，同時跳過愈傷組織誘導不定芽，快繁周期大為縮短，利于生產(chǎn)上規(guī)?；焖俜庇N苗。

參考文獻：

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[2]張海平，周建峰，任目瑾.海沃德獼猴桃組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)研究[J].陜西林業(yè)科技，2011（2）：8-11.

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[4]劉長春，陳澤雄，龔雪芹，等.金富獼猴桃離體培養(yǎng)與植株再生的優(yōu)化研究[J].西南師范大學學報：自然科學版，2007，32（5）：124-128.

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