消乳增膠囊的小鼠急性毒性和大鼠長期毒性研究

葛 斌， 賈 海， 封聚強， 張志宏， 王 輝， 高 湘

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

消乳增膠囊的小鼠急性毒性和大鼠長期毒性研究

葛 斌， 賈 海， 封聚強， 張志宏， 王 輝， 高 湘*

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

目的對我院消乳增膠囊的急性毒性及長期毒性進行評價研究。方法對KM小鼠以高劑量組45.5 g生藥/kg，中劑量組22.8 g生藥/kg，低劑量組11.4 g生藥/kg進行半數(shù)致死量 （LD50）試驗。以原液91.3 g生藥/kg進行最大耐受量 （MTD）試驗、以原液91.3 g生藥/kg，一日兩次進行最大給藥量試驗，觀察15 d測定出現(xiàn)毒性反應(yīng)的劑量。Wistar大鼠灌胃分別給予18.2 g生藥/kg，9.1 g生藥/kg，4.55 g生藥/kg，分別予給藥第6周、第12周，停藥3周各期分別處理一批大鼠進行長期毒性試驗。結(jié)果未測定出LD50、MTD。最大給藥量試驗中仍未出現(xiàn)死亡。試驗結(jié)束進行大體解剖發(fā)現(xiàn)小鼠全消化道外觀與空白組相比顏色呈亮藍綠色，并對之進行病理切片進一步檢查。病理切片顯示未見病理性改變。長毒試驗對大鼠質(zhì)量及臟器指數(shù)各組無統(tǒng)計學差異。血液學檢查各組未見統(tǒng)計學差異。生化指標，試驗初期低劑量組與空白組比較，堿性磷酸酶有所降低 （P＜0.05），葡萄糖高于空白組 （P＜0.05），后兩期差異消失。大體解剖顯示高劑量組1例大鼠肝臟出現(xiàn)出血點和點狀突起。病理切片出現(xiàn)高劑量組大鼠肝細胞壞死、肝纖維化，腎上腺有充血，肺有出血。結(jié)論消乳增膠囊在臨床劑量40倍以下有較好的安全性。

消乳增膠囊；急性毒性；長期毒性

消乳增膠囊是我院研制開發(fā)的中藥制劑，在治療乳癰、乳腺增生癥方面發(fā)揮了重要作用。該膠囊在我院臨床應(yīng)用超過10年，因療效確切，毒副作用小，成為我院的特色中藥制劑?，F(xiàn)用消乳增膠囊，因原工藝條件限制，處方中部分藥材未經(jīng)提取而直接入藥，引起服用后胃部出現(xiàn)不適感；同時，經(jīng)多年臨床應(yīng)用，患者自覺該藥 “止痛”起效慢。因此原處方中增加一味元胡藥材，同時將之前部分藥材水提，部分藥材粉碎入藥改為部分藥材水提，部分藥材醇提，合并提取物后成為本研究制劑。為完善該制劑的安全性評價資料，對急性毒性及長期毒性進行研究，為該藥在臨床更好地服務(wù)于患者提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雌性SPF級KM小鼠40只，體質(zhì)量（20±2）g，健康雌性SPF級Wistar大鼠120只，體質(zhì)量（200±20）g，由甘肅省中醫(yī)學院動物試驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（甘）2011-0001。動物購買后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2 藥物 消乳增膠囊為甘肅省人民醫(yī)院自制制劑，由苦參、當歸、香附、白芍、川楝子等18味中藥組成。由甘肅省人民醫(yī)院制劑中心提供，批號為20131001，批準文號甘藥制字H04000801。該藥處方為甘肅省人民醫(yī)院協(xié)定處方。臨床日劑量為16粒，按成人70 kg計算相當于0.22 g生藥/kg。試驗時混懸液最大質(zhì)量濃度為3.65 g生藥/mL。對最大質(zhì)量濃度混懸液進行適當稀釋備用。

1.3 主要儀器 Olympus 5400全自動生化分析儀；Mindray BC-5390血液分析儀。

1.4 小鼠急性毒性試驗［1-3］根據(jù) 《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導原則》進行急性毒性試驗研究。小鼠灌胃體積為0.25 mL/10 g。對KM小鼠以高劑量組45.5 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量200倍），中劑量組進行22.8 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量100倍），低劑量組11.4 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量50倍）進行半數(shù)致死量 （LD50）試驗。以原液91.3 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量400倍）進行最大耐受量 （MTD）試驗、以原液91.3 g生藥/kg，1日2次 （相當于人臨床服用量日劑量kg體質(zhì)量800倍）進行最大給藥量試驗，確定出現(xiàn)毒性反應(yīng)的劑量?？瞻捉M給同等容積的蒸餾水。觀察指標為外觀，毛發(fā)，行為，活動，糞便，分泌物，食量，飲水量等變化及有無死亡。

1.5 大鼠長期毒性試驗［1，4-6］

1.5.1 分組 取雌性W istar大鼠120只隨機分成4組，每組30只。高劑量組18.2 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量80倍），中劑量組9.1 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量40倍），低劑量組4.55 g生藥/kg（相當于人臨床服用量kg體質(zhì)量20倍）進行長期毒性試驗。空白組給予同等劑量的蒸餾水。

1.5.2 給藥及觀察檢測 試驗期間密切觀察大鼠一般狀況。消乳增膠囊臨床使用療程為2～3周，最長不超過1個月，根據(jù)技術(shù)指導原則長毒連續(xù)給藥觀察時間定為12周。給藥第6周、第12周末次給藥12～24 h，每組隨機選10只大鼠，采用腹主動脈采血5mL分別送檢做血液學指標及血液生化指標。停藥觀察3周做可逆性觀察。病理組織學檢查藥物對臟器的影響。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理 本實驗計量資料用均數(shù)±標準差 （x± s）表示。多組間比較，方差齊的用方差分析，方差不齊的用非參數(shù)檢驗，兩兩比較用t檢驗，全部數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件協(xié)助處理。

2 結(jié)果

2.1 消乳增對小鼠的急性毒性 由于實驗中未能測出LD50及MTD，于是最終以最大給藥量結(jié)果進行分析。給藥后動物少動，約1 h后恢復正常，連續(xù)觀察15 d，動物未見異常，也無死亡。處死動物后，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腸道等臟器。發(fā)現(xiàn)與空白組相比，最大給藥量組小鼠消化道均呈現(xiàn)亮藍綠色，取兩組小鼠消化道做病理切片未見病理性改變。此時小鼠的累積給藥量即最大給藥量達到183 g生藥/kg，相當于70 kg體質(zhì)量的成人臨床每日用量的800倍，相當于臨床等效劑量的91倍，見表1。給藥后連續(xù)觀察15 d期間對小鼠體質(zhì)量進行比較，各組比較未見統(tǒng)計學差異，P＞0.05，見表2。

表1 小鼠最大給藥量結(jié)果

表2 給藥后小鼠體質(zhì)量增長變化 （x±s，n=10）

2.2 消乳增膠囊對大鼠的長期毒性2.2.1 對大鼠一般情況及體質(zhì)量的影響 大鼠灌胃給藥消乳增6周、12周和停藥恢復性觀察3周，消乳增對大鼠的外觀體征、毛色、行為活動、糞便性狀均無明顯影響，試驗期間未出現(xiàn)動物死亡。由表3可以看出，消乳增對各組大鼠體質(zhì)量增長變化未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，P＞0.05。

2.2.2 對大鼠血液學指標的影響 由表4～5可以看出，消乳增對大鼠各試驗階段血常規(guī)的影響各組指標間比較均未出現(xiàn)顯著性差異，P＞0.05。

2.2.3 對大鼠血液生化指標的影響 由表6～7可以看出，消乳增對大鼠血液生化學指標，各組指標間比較均未出現(xiàn)顯著性差異。

2.2.4 對大鼠臟器指數(shù)的影響 由表8～9可以看出消乳增對大鼠臟器指數(shù)不同試驗階段影響沒有統(tǒng)計學差異，P＞0.05。

2.2.5 對大鼠臟器病理影響 在長毒各期大鼠解剖中發(fā)現(xiàn)1例高劑量組大鼠肝臟表面出現(xiàn)出血點和點狀隆起，其他各組大鼠并未出現(xiàn)類似表現(xiàn)。長毒對各組大鼠包括心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、腦、胃、十二指腸、空腸、回腸、直腸共15個臟器進行病理切片，查找出現(xiàn)病理學改變的臟器。病理切片顯示有病理學改變的只在高劑量組出現(xiàn)，病變部位主要集中在肝臟、腎上腺及肺臟。由圖1可以看出肝臟出現(xiàn)纖維化、壞死及出血表現(xiàn)，腎上腺輕度充血，肺有大量出血表現(xiàn)。

表4 消乳增對大鼠給藥12周血常規(guī)的影響 （x±s，n=10）

表5 消乳增對大鼠停藥3周血常規(guī)的影響 （x±s，n=10）

表6 消乳增對大鼠給藥12周血液生化學指標的影響 （x±s，n=10）

表7 消乳增對大鼠停藥3周血液生化學指標的影響 （x±s，n=10）

表8 消乳增對大鼠給藥12周臟器指數(shù)的影響 （x±s，n=10）

表9 消乳增對大鼠停藥3周臟器指數(shù)的影響 （x±s，n= 10）

圖1 大鼠病理陽性結(jié)果及對照 （HE染色，10×20倍）

3 討論

由于之前預(yù)試驗無法測出LD50、最大耐受量，所以考察最大給藥量對小鼠的急性毒性反應(yīng)。由于在臨床多年使用經(jīng)驗判斷，該藥能夠安全、有效地治療乳腺增生。在急性毒性試驗中未顯示出明顯毒性反應(yīng)。在觀察期結(jié)束后進行大體解剖發(fā)現(xiàn)給藥組消化道出現(xiàn)亮藍綠色異常，于是進行病理切片進一步考察有無病理改變。病理切片顯示未見病理改變。分析消化道顏色改變原因可能為給藥組消化道藥物與內(nèi)容物相互作用產(chǎn)生顏色所致，與藥物作用于腸道微生物或致消化道膽綠素增加有關(guān)。該藥在急性毒性試驗中未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，盡管由于種屬差別，但結(jié)合臨床實際經(jīng)驗及該試驗顯示出該藥是安全的。

由試驗結(jié)果可以看出，消乳增對大鼠體質(zhì)量及各臟器指數(shù)的影響并未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，說明對飼料的消耗并不會影響大鼠正常生長、發(fā)育，從這一點來看，消乳增對大鼠消化系統(tǒng)是安全的。

在血液學檢測時常常只注意紅細胞計數(shù)而忽視網(wǎng)織紅細胞的檢查。事實上，紅細胞計數(shù)無論在反映溶血還是反映紅系造血抑制上都不靈敏，特別是對試驗周期不長的長期毒性試驗上來說紅系的變化單靠紅細胞計數(shù)不易被發(fā)現(xiàn)，因為紅細胞壽命很長，平均120 d。在此期限內(nèi)，骨髓紅系造血即使受抑，外周血液也表現(xiàn)不出來。在溶血的情況下，機體可以從儲存庫中將紅細胞動員出來，使外周血紅細胞也不致明顯下降。但血液網(wǎng)織紅細胞計數(shù)卻是一個很敏感的指標，其計數(shù)下降提示紅系造血障礙；增高提示溶血現(xiàn)象［7］。因此從本實驗結(jié)果可以看出消乳增對血液系統(tǒng)沒有明顯影響，各劑量組，各試驗階段均未出現(xiàn)明確的影響，說明該藥對大鼠血液系統(tǒng)是安全的。血液生化指標中，本實驗中堿性磷酸酶低劑量組與空白組比有所降低，但不能說明消乳增對肝功有影響。第一期數(shù)據(jù)顯示葡萄糖與空白組比較，低劑量組有升高，差異有統(tǒng)計學意義，說明消乳增對葡萄糖的代謝有一定影響，葡萄糖升高可能與對甲狀腺、腎上腺和垂體功能的影響有關(guān)，由于實驗所限，并未進一步闡明機理。但之后的實驗對葡萄糖的影響并未出現(xiàn)有統(tǒng)計學差異，說明消乳增對大鼠血糖無長期影響。

實驗中消乳增高劑量組為臨床常用劑量的80倍，在該劑量組個別大鼠出現(xiàn)肝細胞壞死，腎上腺充血及肺出血的表現(xiàn)，而空白組只有一例肺出血，盡管是個別動物出現(xiàn)也不能完全肯定該藥在80倍臨床劑量下是安全的。中、低劑量組并未出現(xiàn)病理改變，說明該藥在中、低劑量下即臨床劑量的40倍、20倍時是安全的。

至于對肝細胞的損害，經(jīng)分析認為，消乳增方中有一味藥是川楝子。川楝子（Toosendan Fructus）為臨床常用藥，《中國藥典》2010年版［8］所載川楝子為楝科植物川楝的干燥成熟果實，性味苦寒，有小毒，歸肝、小腸、膀胱經(jīng)，具有疏肝泄熱，行氣止痛，殺蟲等功效，臨床用于治療胸脅、脘腹脹痛，疝氣痛，蟲積腹痛。有關(guān)川楝子毒性的記載首見于 《名醫(yī)別錄》。有多篇報道川楝子的毒性主要在肝臟，通過炎癥反應(yīng)加重肝細胞的損傷，最后導致肝損傷。所以這也可以部分解釋高劑量組會對肝臟有一定毒性，導致纖維化及壞死等。盡管川楝子入藥為炮制品，毒性有所降低，但高劑量長期使用對肝毒性的研究有待于進一步深入探索。

［1］衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南 （藥學、藥理學、毒理學）［M］.1994：202-209.

［2］中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導原則課題研究組.中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導原則：第二稿［M］.北京：國家食品藥品監(jiān)管局，2004：1-9.

［3］陳 奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：112-119.

［4］中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導原則課題研究組.中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導原則［M］.北京：國家食品藥品監(jiān)管局，2005：1-12.

［5］李建榮，黃芳華.中藥新藥長期毒性實驗設(shè)計及常見問題分析［J］.中國新藥雜志，2004，13（9）：769-772.

［6］李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.2版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2006：1008-1018.

［7］胡 雷.藥物非臨床研究與臨床試驗質(zhì)量管理實務(wù)全書［M］.北京：當代中國音像出版社，2003：353-354.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：39-40.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1107-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.042

2014-06-15

甘肅省自然科學研究基金計劃 （1107RJZA130）

葛 斌（1965—），男，碩士生導師，從事中藥安全性評價研究。E-mail：gjy0630@163.com

*通信作者：高 湘 E-mail：1071359340@qq.com

日期：2014-12-24

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141224.1554.001.htMl