多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝

鄧少東， 林 勵(lì)， 張 鵬

（1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝

鄧少東1， 林 勵(lì)2*， 張 鵬2

（1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝。方法在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法，以液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以出膏率及低聚糖、巴戟甲素和耐斯糖提取率為指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)分。結(jié)果優(yōu)選出的最佳提取工藝為加入15倍量的40%乙醇浸泡24 h，提取2次，每次1.0 h。結(jié)論優(yōu)化的提取工藝結(jié)果可靠，評(píng)價(jià)指標(biāo)可控，對(duì)巴戟天的質(zhì)量控制與開(kāi)發(fā)利用具有一定意義。

巴戟天；低聚糖；多指標(biāo)；正交試驗(yàn)；提取

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的肉質(zhì)根，歸腎、肝經(jīng)，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)之功效，自古被譽(yù)為 “補(bǔ)腎陽(yáng)之要藥”，已證實(shí)巴戟天糖類物質(zhì)的量近50%，其中以低聚糖類成分為主［1］。近期藥效研究表明，巴戟天低聚糖可顯著提高擬癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［2］、改善癡呆癥狀［3］，其中巴戟甲素、耐斯糖等低聚糖單體活性成分也顯示具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［4］、抗抑郁［5］、抗骨質(zhì)疏松［6］等多種生物活性，表明巴戟天低聚糖類成分具有顯著的開(kāi)發(fā)利用前景。然而，目前巴戟天糖類成分提取工藝研究主要采用UV法檢測(cè)，以總多糖或總低聚糖含有量為指標(biāo)進(jìn)行研究［7-8］，其選擇指標(biāo)單一、不夠系統(tǒng)全面。本課題組在前期研究［9］中已建立巴戟天中多種低聚糖類成分量的測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)巴戟甲素、耐斯糖在藥材中的量較高，其中耐斯糖為 《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的質(zhì)控指標(biāo)，而巴戟甲素具有顯著的生物活性［10-13］。為此，本實(shí)驗(yàn)以巴戟天低聚糖提取物的出膏率、低聚糖提取率以及其主要的活性成分巴戟甲素、耐斯糖提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選巴戟天低聚糖的提取工藝，以期為巴戟天藥材的質(zhì)量控制、生產(chǎn)加工及其低聚糖類成分的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

美國(guó)Waters 2695型液相系統(tǒng)（配備Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Genpure超純水系統(tǒng)（德國(guó)TKA公司）；XB ridge TMAmide親水性色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，美國(guó)Waters公司）；Cary50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）；KQ-500型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Freezone 2.5 L冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）；RV5型真空泵（英國(guó)Edwards公司）；佳美SK-1快速混勻器 （江蘇金壇市佳美儀器廠）；HHS6數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州普天儀器公司）。

巴戟甲素 （按專利201010224513.2方法自制，純度98.8%）；耐斯糖（日本W(wǎng)AKO公司，純度99%，批號(hào)292-64121）；果糖（美國(guó)Amresco公司，純度99%，批號(hào)57-48-7）；乙腈 （色譜純，美國(guó)Merk公司）；三乙胺、鹽酸、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為自制超純水；巴戟天藥材于2012年1月購(gòu)自廣東德慶巴戟天GAP基地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心林勵(lì)研究員鑒定，其原植物為茜草科巴戟天屬巴戟天Morinda officinalis How。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取巴戟天粉末50 g（過(guò)3號(hào)篩），精密稱定，按實(shí)驗(yàn)要求，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑浸泡過(guò)24 h后，于不同料液比中90℃水浴回流提取不同時(shí)間、次數(shù)。濾過(guò)，取濾液濃縮至稠浸膏后，冷凍干燥，計(jì)算得出膏率（出膏率=干膏質(zhì)量÷藥材總質(zhì)量）。精密稱取干膏0.1 g，移至10 mL量瓶中，加40%乙醇至刻度，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 定量測(cè)定 取上述供試品溶液，分別按照本課題組前期建立的UV法測(cè)定低聚糖的量、親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［9，14］測(cè)定巴戟甲素及耐斯糖的量。

2.3 單因素考察試驗(yàn) 以料液比 （1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）為主要考察因素，分別考察各因素對(duì)出膏率及低聚糖、巴戟甲素和耐斯糖提取率 （提取率=各指標(biāo)測(cè)得含有量×出膏率）的影響，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 料液比對(duì)提取效果的影響Tab.1 Effects of liquid-solid ratio on extraction

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Tab.2 Effects of ethanol concentration on extraction

表3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Tab.3 Effects of time on extraction

由表1可知，隨著料液比的增大，出膏率也逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)出膏率最大，高達(dá)73.56%；當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率均趨近最大值，其提取率分別為52.88%、4.21%、4.25%。因此，本實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20 3個(gè)水平進(jìn)行考察。

由表2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，各指標(biāo)得率均逐漸下降。根據(jù)前期研究［8］，當(dāng)提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，會(huì)提取出部分多糖影響測(cè)定結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%3個(gè)水平進(jìn)行考察。

由表3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，各指標(biāo)得率均逐漸上升。推測(cè)有部分多糖水解或溶出，影響檢測(cè)，同時(shí)為了節(jié)省的原因，故本實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5 h 3個(gè)水平進(jìn)行考察。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （見(jiàn)表4），結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步考察料液比 （A）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù) （D）對(duì)出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率的影響，并采用綜合評(píng)價(jià)中的TOPSIS法［15-16］對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，以確定最佳提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Result of orthogonal test and analysis

表5 綜合評(píng)分方差分析Tab.5 ANOVA analysis

采用TOPSIS法計(jì)算出各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)分別為：低聚糖提取率 （35.6%） ＞巴戟甲素提取率 （23.8%）＞耐斯糖提取率 （21.3%） ＞出膏率 （19.3%）。

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：因素A的K值為K2＞K3＞K1，說(shuō)明料液比1∶15的提取較好；因素B的K值為K1＞K3＞K2，說(shuō)明40%乙醇提取較好；因素C的K值為K2＞K1＞K3，說(shuō)明提取時(shí)間為1.0 h提取較好；因素D的K值為K2＞K3＞K1，說(shuō)明提取次數(shù)為2次時(shí)提取較好。

由直觀分析表明，因素B的極差R值最大，因此是主要影響因素。其次是因素C、A、D，故各因素對(duì)出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率的影響程度依次為溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞液固比＞提取次數(shù)。

由方差分析結(jié)果可得出，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著性影響。因此，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選出的最佳工藝條件為A2B1C2D2，即用15倍量的40%乙醇，提取2次，每次1 h。

2.5 提取工藝驗(yàn)證 分別精密稱取同一批巴戟天藥材粉末 （過(guò)3號(hào)篩），平行3份，各50 g，用15倍量的40%乙醇浸泡24 h后，于90℃水浴回流提取1.0 h，濾過(guò)，取濾渣再次提取1.0 h，合并濾液，濃縮至稠浸膏后，冷凍干燥。在此工藝下，出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖的提取率分別為（81.79±1.06）%、（65.31±2.21）%、（6.37± 0.15）%、（7.39±0.17）%，說(shuō)明采用的最佳工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期曾取同一批巴戟天藥材連續(xù)提取3次，發(fā)現(xiàn)第3次的提取液中所含成分已較少，從節(jié)約成本出發(fā)本研究的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取1～3次。曾采用純水提取，由于巴戟天中還含有多糖等水溶性成分，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾夠大，且影響巴戟甲素、耐斯糖的定量測(cè)定，因此本研究采用30%以上的乙醇溶液對(duì)藥材進(jìn)行提取，可避免干擾。

多指標(biāo)優(yōu)選中藥提取工藝是提高中藥制劑質(zhì)量的重要手段，符合中藥中多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，能更合理的評(píng)價(jià)整個(gè)工藝過(guò)程。目前，中藥提取工藝綜合評(píng)價(jià)中常用的經(jīng)驗(yàn)性權(quán)數(shù)法，主要是由專家或研發(fā)者根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要性來(lái)確定權(quán)重系數(shù)，主觀因素影響較大。而本實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)中的TOPSIS法，計(jì)算出各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)，同時(shí)對(duì)各指標(biāo)的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)分并綜合分析，結(jié)合生產(chǎn)上提取成本等因素，最終確定最佳提取工藝，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝各指標(biāo)性成分的提取率較高，工藝合理、可行。

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Extraction optiMization of oligosaccharides froMMorindae Officinalis Radix by multi-index orthogonal experiment

DENG Shao-dong1， LIN Li2*， ZHANG Peng2
（1.Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China；2.College of ChineseMateria Medica，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Morindae officinalis Radix；oligosaccharide；multi-index；orthogonal experiment；extraction process

R284.2

：A

：1001-1528（2015）05-0978-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.011

2014-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81403085）；東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃一般項(xiàng)目 （2014105101295）；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金博士學(xué)位人員科研啟動(dòng)項(xiàng)目 （B2013007）

鄧少東（1986—），男，博士，從事中藥資源開(kāi)發(fā)利用與新藥研究。E-mail：donggdyxy@163.com

*通信作者：林 勵(lì) （1954—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源開(kāi)發(fā)利用與新藥研究。Tel：（020）39358270，E-mail：LL76611@126.com