連花清瘟膠囊對(duì)脂多糖致急性肺損傷小鼠IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的影響

崔雯雯， 金 鑫， 張彥芬， 常麗萍， 王宏濤，3*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊050035；3.河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050035；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局心腦血管絡(luò)病重點(diǎn)學(xué)科，河北石家莊050035）

連花清瘟膠囊對(duì)脂多糖致急性肺損傷小鼠IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的影響

崔雯雯1， 金 鑫1， 張彥芬2，3， 常麗萍2，4， 王宏濤1，3*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊050035；3.河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050035；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局心腦血管絡(luò)病重點(diǎn)學(xué)科，河北石家莊050035）

目的探討連花清瘟膠囊對(duì)經(jīng)氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）致小鼠急性肺損傷引起的肺組織炎癥因子和IKK/IκB/ NF-κB信號(hào)通路的蛋白表達(dá)的影響。方法將急性肺損傷的100只SPF級(jí)18～20 g雄性KM小鼠隨機(jī)均分為5組，LPS組，地塞米松組，連花清瘟膠囊高、中、低劑量組，另設(shè)正常對(duì)照組 （n=20）。光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織病理變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中白介素-6（IL-6）的陽(yáng)性表達(dá)率，RT-PCR法檢測(cè)肺組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)肺組織中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，LPS組小鼠肺組織中有大量炎性細(xì)胞滲出，外周血中IL-6，肺組織中MCP-1 mRNA，NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá)均明顯升高；與脂多糖組相比，外周血中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率用藥組均有所下降，肺組織中MCP-1mRNA表達(dá)用藥組均改善明顯，肺組織中NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá)為地塞米松組與高劑量組改善較明顯，連花清瘟中、低劑量組也有不同程度改善。結(jié)論連花清瘟膠囊能夠通過(guò)降低IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)來(lái)減輕肺內(nèi)炎癥反應(yīng)程度。

連花清瘟膠囊；急性肺損傷；IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由肺內(nèi)外多種因素引起的多種炎癥因子參與的過(guò)度的失控的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［1-2］。目前研究認(rèn)為，NF-κB是調(diào)節(jié)急性肺損傷的多種炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、趨化因子的主要核轉(zhuǎn)錄因子［3-4］。NF-κB是一種具有多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，以三聚體形式存在于胞漿內(nèi)的NF-κB激活主要依賴于NF-κB抑制劑（IκB）的磷酸化，IκB激酶（IKK）對(duì)NF-κB的降解也起到調(diào)控的作用，因此，IKK/IκB/NF-κB是一個(gè)有機(jī)聯(lián)系的系統(tǒng)［5］。已有大量研究證明［6］， 脂多糖（LPS）經(jīng)常被用于制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性肺損傷模型，其成模性強(qiáng)且容易復(fù)制。連花清瘟膠囊 （連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草）具有廣譜抗病毒、抑菌作用，對(duì)呼吸道、肺部感染均有一定的治療作用［7］。因此，本研究采用LPS誘發(fā)小鼠急性肺損傷，探究IKK/IκB/NF-κB系統(tǒng)與急性肺損傷的聯(lián)系及連花清瘟膠囊的干預(yù)作用。

1 儀器設(shè)備

3K15型低溫高速離心機(jī) （德國(guó)Sigma公司）；Leica RM2015切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Olympus IX71熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；UVP凝膠掃描系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；DYZ-22A型雙恒定時(shí)電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYY-Ⅲ橋式電泳槽 （北京市六一儀器廠）。

2 藥物與試劑

連花清瘟膠囊 （石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司）；地塞米松片 （批號(hào)130211，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；LPS（批號(hào)102M4017V，德國(guó)Sigma公司）；Western印跡檢測(cè)抗體：NE兔抗小鼠多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；NF-K B P65兔抗小鼠多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；IκB alpha兔抗小鼠多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；IKK beta兔抗小鼠單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；RNA提取試劑Trizol Reagent（美國(guó)Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）；瓊脂糖（美國(guó)Promega公司）；熒光定量PCR試劑盒（加拿大BBI公司）。

3 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)雄性KM小鼠120只，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0017。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，隨機(jī)分成6組，每組20只，分別為正常對(duì)照組，脂多糖組，地塞米松組，連花清瘟膠囊高、中、低劑量組。供試品采用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，地塞米松組給予5 mg/kg的地塞米松，連花清瘟膠囊高、中、低劑量組分別給予8、4、2 g/kg的蓮花清瘟膠囊，正常對(duì)照組和脂多糖組灌胃給予等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)7 d，每天1次。

4 造模方法

末次給藥24 h后，除正常對(duì)照組外其余5組，用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，將小鼠固定在手術(shù)板上，頸部消毒，縱向切開(kāi)頸部皮膚，剝離皮下組織，暴露氣管，用1 mL注射器注射脂多糖生理鹽水溶液（5 mg/kg）2 ML，從氣管兩氣管環(huán)間快速刺入注射，滴入后立即直立小鼠，輕度晃動(dòng)數(shù)次以使液體能夠均勻分布于肺內(nèi)后縫合傷口，待小鼠自然清醒。

5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

5.1 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠眼球取血后處死，開(kāi)胸取肺。取左肺上葉組織塊，放入10%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片 （片厚5μm），于切片中任意抽取其中3張切片，HE染色。光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

5.2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)外周血中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率 肝素抗凝，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-6。首先進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離，然后采用佛波酯 （PMA）和離子霉素刺激淋巴細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞，Exp32軟件獲取分析細(xì)胞，每個(gè)檢測(cè)獲取10 000個(gè)細(xì)胞，采用前向角 （FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，分析胞內(nèi)抗原的表達(dá)。

5.3 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)MCP-1的mRNA表達(dá)水平 用Trizol試劑提取肺組織總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織中MCP-1的mRNA表達(dá)水平，引物序列如下：MCP-1，158 bp，正向5＇-ACTTCTATGCCTCCTGCTCAT-3＇，反向5＇-ACTGGCTGCTTGTGATTCTC-3＇；GAPDH，120 bp，正向5＇-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，反向5-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3＇。以GAPDH為內(nèi)參照基因，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值 （RQ值）。

5.4 Western blot法檢測(cè)肺組織中NE、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá) 稱取小鼠肺組織加入組織裂解液，勻漿后4℃離心分離上清，進(jìn)行蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜后封閉，與一抗結(jié)合后洗膜，二抗結(jié)合，洗膜后采用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，掃描灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH比值表示。

6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為連續(xù)性變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊性，使用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)后多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

7 結(jié)果

7.1 光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯充血、無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚等病理改變；脂多糖組可見(jiàn)肺泡腔內(nèi)存在大量中性粒細(xì)胞為主、少量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的滲出物，有紅細(xì)胞滲出，肺泡壁明顯增厚，肺泡間質(zhì)可見(jiàn)明顯增生、水腫；地塞米松組較脂多糖組，炎細(xì)胞滲出明顯減少，少量紅細(xì)胞滲出，增生、水腫明顯減輕；與脂多糖組比較，連花清瘟膠囊各劑量組小鼠肺部病理形態(tài)損傷均有不同程度改善，高劑量組可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞等滲出物，水腫、增生等情況明顯改善，中劑量組肺內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、紅細(xì)胞滲出、增生等，但均有減輕；低劑量組仍可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞等滲出，肺泡壁薄厚不均，但較脂多糖組也有減輕。結(jié)果如圖1。

7.2 外周血中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率 脂多糖進(jìn)入肺內(nèi)后可致炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子IL-6。同正常對(duì)照組相比，脂多糖組小鼠外周血中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率明顯上升 （P＜0.01），提示小鼠體內(nèi)炎癥因子大量表達(dá)；同LPS組相比，連花清瘟膠囊各劑量組IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率均有所降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)損傷Fig.1 Pathological in juries in lung tissues of theMice （HE staining，×400）

圖2 外周血中IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率Fig.2 Expression rate of IL-6 in peripheral b lood

7.3 肺組織中MCP-1 mRNA的表達(dá) 脂多糖致肺損傷可致MCP-1大量表達(dá)，趨化炎癥細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)。同正常對(duì)照組相比，脂多糖組小鼠肺組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；同LPS組相比，連花清瘟膠囊各劑量組肺組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)均有所降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

7.4 肺組織中NE、NF-κB P65、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá) 脂多糖組小鼠肺組織中NE（中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶）的蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組 （P＜0.01），提示脂多糖進(jìn)入肺內(nèi)后引起中性粒細(xì)胞增多，大量釋放NE；同脂多糖組相比，連花清瘟膠囊各劑量組表達(dá)量均有不同程度降低。IKK/IκB/NF-κB是一個(gè)有機(jī)的信號(hào)通路，與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。脂多糖組小鼠肺組織中NF-κB P65、IκBα、IKKβ的蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組 （P＜0.01）；連花清瘟膠囊各劑量組表達(dá)均較LPS組不同程度降低。結(jié)果見(jiàn)圖3，表2。

圖3 肺組織中NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBα的蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of NE、NF-κB P65、IKKβ and IκBαin lung tissues

表2 肺組織中NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBα的蛋白表達(dá)Tab.2 Protein expression of NE、NF-κB P65、IKKβ、IκBαin lung tissues

8 討論

急性肺損傷是由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素引起的以肺內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出、肺泡-毛細(xì)血管膜通透性增加為特征的肺部炎性綜合反映，臨床上常表現(xiàn)為頑固性低氧血癥、進(jìn)行性呼吸困難、非心源性肺水腫等，最終導(dǎo)致急性的進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，病死率高達(dá)30%～50%［8-9］。脂多糖 （LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，將LPS經(jīng)由氣管內(nèi)滴入小鼠肺內(nèi)后能夠引起肺內(nèi)炎癥細(xì)胞增多、通透性改變等［10］。本研究中，脂多糖組小鼠肺內(nèi)由病理染色可見(jiàn)大量炎細(xì)胞聚集，外周血中IL-6、肺組織中MCP-1、NE的表達(dá)明顯升高，IL-6是肺內(nèi)主要的炎癥因子之一，參與肺損傷時(shí)肺內(nèi)炎癥的過(guò)度反應(yīng)；MCP-1可以趨化和聚集中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)［11］；NE是中性粒細(xì)胞釋放的一種參與肺損傷多環(huán)節(jié)的蛋白酶［12］。

NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種炎癥反應(yīng)中炎性介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，在急性肺損傷的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。目前可知，NF-κB信號(hào)通路主要由p50（p105的處理產(chǎn)物）、p52（p100的處理產(chǎn)物）、p65（也稱為Rel-A）、Rel-B、cRel等轉(zhuǎn)錄因子，7個(gè)NF-κB抑制蛋白如IκBα、IκBβ等和IκB激酶復(fù)合物IKKα、IKKβ、調(diào)節(jié)亞基NEMO組成，被分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，NF-κB以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，它與抑制蛋白IκB結(jié)合組成一個(gè)三聚體p50-p65-IκB。在經(jīng)典通路中，當(dāng)細(xì)胞受到胞內(nèi)外因素刺激傳導(dǎo)至胞漿后，可激活NF-κB誘導(dǎo)性激酶（NIK），活化的NIK又激活I(lǐng)κB激酶IKK，作為促炎反應(yīng)因子刺激誘導(dǎo)NF-κB激活的主要激酶的IKK復(fù)合體被活化，IKKα、IKKβ及NEMO組成的信號(hào)小體被激活后可磷酸化 p65蛋白，同時(shí)促使IκB磷酸化，使其因泛素化被蛋白酶體降解，胞漿內(nèi)的p50和p65蛋白二聚體被解聚處于游離狀態(tài)，活化的NF-κB一方面轉(zhuǎn)位到胞核內(nèi)快速誘導(dǎo)編碼自身抑制劑IKBα的基因的轉(zhuǎn)錄，新合成的IκBα進(jìn)入細(xì)胞核，使NF-κB與DNA解離并排出細(xì)胞核，等待重新激活。因此，IKK/IκB/NF-κB是一個(gè)有機(jī)的信號(hào)通路。另一方面，NF-κB游離后進(jìn)入細(xì)胞核，與目的基因結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)下游炎癥因子等基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，而這些炎癥因子又成為了促進(jìn)NF-κB重新激活的刺激因素，從而導(dǎo)致了級(jí)聯(lián)性彌漫性炎癥反應(yīng)［13-16］。本研究中，脂多糖組肺組織中NF-κB、IκBα、IKKβ蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組的增加，也說(shuō)明了巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等釋放的炎癥因子促使IKK復(fù)合物（IKKβ）激活了IκBα的磷酸化，使本與IκBα結(jié)合的NF-κB釋放出來(lái)，游離進(jìn)細(xì)胞核，從而啟動(dòng)了對(duì)下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄翻譯。這些炎癥因子的產(chǎn)生能夠促使炎癥細(xì)胞大量產(chǎn)生、聚集，同時(shí)又重新啟動(dòng)IKK/IκB/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。

連花清瘟膠囊是廣譜抑菌、抗炎的中藥復(fù)方制劑，具有清瘟解毒、宣肺泄熱的作用。既往研究顯示［17-18］，它對(duì)急性呼吸道感染、急性炎癥、慢性阻塞性肺部疾病均具有明顯的治療作用。本研究中，連花清瘟膠囊中、高劑量組能夠降低NF-κB、IκBα、IKKβ的表達(dá)，同時(shí)降低外周血中IL-6、肺組織中MCP-1、NE的表達(dá)，說(shuō)明在一定程度上能夠抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及釋放炎癥因子，降低免疫反應(yīng)的放大程度，減輕了肺損傷。

綜上所訴，NF-κB信號(hào)通路在內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用，在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放的炎癥因子刺激下可能參與并介導(dǎo)了整個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程。連花清瘟膠囊通過(guò)抑制IKK/IκB/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、降低肺內(nèi)炎細(xì)胞數(shù)量、減少炎癥因子的表達(dá)，減輕了內(nèi)毒素導(dǎo)致的肺損傷程度，但此過(guò)程具體與哪些炎癥因子有關(guān)和整個(gè)反應(yīng)中調(diào)控的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究解釋。

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Effects of Lianhua Qingwen Capsules on IKK/IκB/NF-κB signal pathway in the mouse w ith LPS-induced acute lung injury

CUIWen-wen1， JIN Xin1， ZHANG Yan-fen2，3， CHANG Li-ping2，4， WANG Hong-tao1，3*
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Yiling Medical Research Institute of Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China；3.Key Laboratory of Network Diseaseof Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China；4.Key Disciplinesof Cardio-Cerebral Vascular Network Disease，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050035，China）

AIMTo observe the effectsof Lianhua Qingwen Capsules on inflammatory factors and NF-kappa B signaling pathway in the acute lung injury induced by the intratracheal instillation of LPS in mice.METHODSOne hundred male SPF Kunmingmice weighing 18-20 g were randomly divided into five groups：LPSgroup，Lianhua Qingwen Capsules low，middle，and high dose groups，and Dexamethasone group.In addition，the pathological changes of the normal control groups in the lung tissues of the mice were observed by opticalmicroscopy. Flow cytometry detected expression rate of IL-6 in peripheral blood.The expression of MCP-1 mRNA was detected by RT-PCRmethod and the protein expression of NE，NF-κB，IKKβ，IκBαin the lung tissue was detected by Western blot.RESULTSCompared with the normal control group，the LPS group presented a large number of infiltrating inflammatory cells，markedly increased the expression rate of IL-6 in peripheral blood，MCP-1 mRNA and NE，NF-κB，IκBα，IKKβprotein expression in lung tissue ofmice.Compared with the LPS group，the expression rate of IL-6 in peripheral blood decreased and MCP-1 mRNA expression improved in three Lianhua Qingwen groups and Dexamethasone group.NE，NF-κB，IκBα，IKKβprotein expression improved in four treatment groups，especially in Lianhua Qingwen high dose group and Dexamethasone group while Lianhuaqingwen middle，low dose groups improved to some extent.CONCLUSIONLianhua Qingwen Capsules can reduce the inflammatory reaction through the reduction of the expression of IKK/IκB/NF-κB in the lungs.

Lianhua Qingwen Capsules；acute lung injury；IKK/IκB/NF-κB signaling pathway

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0953-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.006

2014-10-08

國(guó)家科技部 “十二五重大新藥創(chuàng)制”（2011ZX09201-201-27）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃 （2014227）

崔雯雯（1991—），女，碩士生，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail：reaishenghuo0506@163.com

*通信作者：王宏濤（1972—），男，博士，高級(jí)工程師，從事糖尿病周圍神經(jīng)病變研究。E-mail：wanghongtao@yiling.cn