真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗體制備及ELISA競爭法檢測體系的建立

嚴(yán)俊，楊葳，翟栓柱，薛知信，郁彭，周澤奇

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;2.天津市醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，天津300070)

真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗體制備及ELISA競爭法檢測體系的建立

嚴(yán)俊1，楊葳2，翟栓柱1，薛知信1，郁彭1，周澤奇1

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;2.天津市醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，天津300070)

目的建立高特異性和敏感性的(1，3)-β-D-葡聚糖酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測體系。方法經(jīng)蛋白修飾的(1，3)-β-D-葡聚糖和真菌提取物作為免疫原制備兔多克隆抗體，并對高效價交叉反應(yīng)弱的抗體進(jìn)行純化和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，最后建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。結(jié)果建立的ELISA競爭法檢測體系線性范圍為3.125～200 pg/mL。添加100、25和6.25 pg/mL抗原的血清回收率為97.8%～113.6%，重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)＜15%。該檢測體系能有效地從血清樣本中檢出低濃度的煙曲霉、白念珠菌和高濃度的隱球菌，并且對結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌5種細(xì)菌抗干擾能力強(qiáng)。結(jié)論利用(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被抗原，酶標(biāo)抗體HRP-Ab3B作為檢測抗體，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。

(1，3)-β-D-葡聚糖;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);侵襲性真菌病

現(xiàn)代移植醫(yī)學(xué)的發(fā)展、獲得性免疫缺陷綜合征等多種因素使低免疫人群增多，侵襲性真菌感染的發(fā)生率迅速增長。侵襲性真菌感染癥狀無特異性，診斷困難，有效治療時間短，死亡率高。建立特異、快速、敏感的侵襲性真菌病檢測方法是臨床診療的需要。常用的鱟試劑檢測(1，3)-β-D-葡聚糖的試驗(yàn)條件苛刻，假陽性因素過多(包括內(nèi)毒素污染、溶血和部分抗腫瘤藥物等)且不能檢出隱球菌和毛霉菌等［1-3］。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)成熟，成本相對較低，診斷快速，便于臨床實(shí)驗(yàn)室使用。因此，建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA檢測體系具有十分重要的臨床應(yīng)用價值。

材料和方法

一、材料

1.試驗(yàn)動物雄性新西蘭兔(約2 kg/只)，由天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院提供和飼養(yǎng)。

2.抗原和菌種海帶多糖、茯苓多糖、凝膠多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖和隱球菌莢膜多糖由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，曲霉菌種由北京協(xié)和醫(yī)院提供。

3.主要試劑牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)購自上海生工生物工程有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Abbkine公司，其它試劑購自Sigma公司。

4.主要儀器SPECTRAMAX 190酶標(biāo)儀購自Molecular Devices公司，1260 Infinity高效液相色譜儀購自Agilent公司，?KTA蛋白純化系統(tǒng)FPLC購自Amersham Biosciences公司。

二、方法

1.免疫原制備(1，3)-β-D-葡聚糖免疫原制備:使用過碘酸鹽氧化法［4］和DMTMM試劑法［5］對(1，3)-β-D-葡聚糖(包括海帶多糖、茯苓多糖和凝膠多糖等)進(jìn)行BSA修飾。煙曲霉菌體和孢子免疫原制備:煙曲霉經(jīng)液體30℃200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后過濾收集菌體［6］。用3.7%甲醛滅活，生理鹽水洗滌。倒入液氮研磨破碎，收集上清液。煙曲霉經(jīng)30℃平皿固體培養(yǎng)72 h后洗脫收集孢子。用3.7%甲醛滅活，生理鹽水洗滌。用血球板法計數(shù)，超聲波破碎，獲得孢子破碎液。

2.動物免疫將免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化后對新西蘭兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。再次免疫改用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后，每隔1周進(jìn)行耳動脈采血，測定抗血清效價。當(dāng)免疫后效價不再升高時，頸動脈放血，分離抗血清。

3.間接法測定效價用磷酸鹽緩沖液稀釋抗原作為包被液，在4℃包被過夜后棄去，洗液洗滌3次，封閉液封閉。用磷酸鹽緩沖液梯度稀釋抗血清/多克隆抗體后加到酶標(biāo)板上，37℃孵育1 h，洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30 min，洗板后加入四甲基聯(lián)苯胺底物，37℃顯色15 min后終止。測定450 nm吸光度(A450nm)值。將A450nm值在0.4～0.6之間的抗血清/多克隆抗體的稀釋倍數(shù)作為其效價。

4.多克隆抗體和HRP標(biāo)記抗血清先依次用50%和33%飽和硫酸銨鹽析，再用瓊脂糖凝膠Protein A親和層析，獲得高純度的多克隆抗體［7］。最后用十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

用過碘酸鹽氧化法對抗體Ab-3B進(jìn)行HRP標(biāo)記。再用?KTA蛋白純化儀分離純化并實(shí)時檢測A280nm值，收集第1個蛋白峰，命名為酶標(biāo)抗體HRP-Ab3B。

5.真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法體系酶標(biāo)板包被:用磷酸鹽緩沖液稀釋的(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被液，37℃過夜包被，洗板后用封閉液封閉。樣本處理:取300 μL血清樣本，加入100 μL乙二胺四乙酸二鈉處理液，振蕩混勻，沸水浴3 min，10 000×g離心10 min。競爭法檢測:酶標(biāo)板上依次加入50 μL抗原標(biāo)準(zhǔn)品［(1， 3)-β-D-葡聚糖濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.563 pg/mL］或處理后樣本上清液，再加入50 μL適當(dāng)濃度的酶標(biāo)抗體HRPAb3B，混勻后37℃孵育60 min，洗板后加四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，37℃顯色15 min后終止。測定A450nm值。

6.ELISA競爭法體系性能驗(yàn)證(1)線性: ELISA競爭法重復(fù)檢測3次，計算線性相關(guān)系數(shù); (2)檢測限:將Tris-HCl樣本稀釋液作為樣本，重復(fù)檢測20次，用文獻(xiàn)［8］的方法計算檢測限;(3)回收率和重復(fù)性:用加100、25和6.25 pg/mL凝膠多糖的3種正常人血清作為樣本，用處理液處理后重復(fù)檢測10次;(4)交叉反應(yīng):將8種病原菌(結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、煙曲霉、白念珠菌和隱球菌)干粉添加到健康人血清中并進(jìn)行梯度稀釋，樣本經(jīng)同樣的方法處理后進(jìn)行檢測，觀察非真菌抗原是否出現(xiàn)假陽性。

結(jié)果

一、抗血清效價和交叉試驗(yàn)

采集全血后分離的血清，用茯苓多糖、凝膠多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隱球菌莢膜多糖包被酶標(biāo)板使用間接法進(jìn)行檢測?？寡逍r超過16 000的兔子有11只(除去與其它真菌多糖抗原存在嚴(yán)重交叉反應(yīng)的3只)。其中(1，3)-β-D-葡聚糖免疫獲得抗血清效價高，且與其它抗原交叉反應(yīng)弱。選擇其中效價最高的1B、2C、3B和6A的兔血清進(jìn)行純化。

二、多克隆抗體Ab-3B電泳鑒定

抗血清純化的抗體中，Ab-3B效價最高，效價為16 000。對其進(jìn)行電泳鑒定。根據(jù)Marker條帶遷移率可知，抗體Ab-3B蛋白帶的相對分子質(zhì)量為50 000和25 000，與抗體輕鏈和重鏈的相對分子質(zhì)量完全一致，且無其它雜蛋白條帶。由此證明，純化后抗體Ab-3B中無其它雜蛋白。見圖1。

圖1 多克隆抗體Ab-3B電泳圖

三、ELISA競爭法檢測體系驗(yàn)證

建立的ELISA競爭法檢測體系的線性范圍為3.125～200 pg/mL;重復(fù)檢測3次，曲線擬合方程的r2值均＞0.98，見圖2;檢測限為2.130 pg/mL;含高、中和低濃度(100、25和6.25 pg/mL)抗原血清檢測到濃度值依次為(97.80±9.53)、(26.50± 3.71)、(7.10±0.98)pg/mL，回收率為97.8%～113.6%，變異系數(shù)均＜15%;含10 μg/m L細(xì)菌病原菌(結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌)干粉的血清均無法檢出(1，3)-β-D-葡聚糖，3種常見的真菌病原菌(低濃度的煙曲霉、白念球菌和高濃度的隱球菌)均能檢測到(1，3)-β-D-葡聚糖。見表1。

圖2 ELISA競爭法的標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證

表1 菌體干粉添加到血清ELISA競爭法檢測結(jié)果對比(pg/mL)

討論

本研究創(chuàng)新利用修飾的(1，3)-β-D-葡聚糖作為包被抗原，酶標(biāo)抗體HRP-Ab3B作為檢測抗體，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系。試驗(yàn)中使用的抗體Ab-3B具有很高的特異性，避免與其它真菌多糖的交叉反應(yīng)。該檢測體系不僅能從血清中檢出低濃度的曲霉和白念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖，而且可以檢測高濃度的隱球菌(1，3)-β-D-葡聚糖，與5種臨床常見病原菌(結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、克雷伯菌和金黃色葡萄球菌)無交叉反應(yīng)。此外，本檢測體系敏感性高，檢測限為2.130 pg/m L，檢測時間短，2 h內(nèi)完成檢測，提高了目前臨床上(1，3)-β-D-葡聚糖鱟試劑檢測方法的特異性。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是把原來非特異性的鱟試驗(yàn)檢測方法改變?yōu)樘禺愋缘腅LISA檢測方法，類似研究未見報道。原鱟試驗(yàn)方法特異性較差，內(nèi)毒素污染、多糖類藥物等都會使其呈假陽性，無法檢測溶血、高脂、黃疸、渾濁等特殊樣本。ELISA檢測體系使用免疫學(xué)原理，因此不存在內(nèi)毒素的干擾，溶血或其他特殊樣本經(jīng)處理液處理后也能正常檢測。由此可見，相對于鱟試劑，ELISA具有明顯優(yōu)勢。

本研究雖然建立了真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA競爭法檢測體系，但是該體系的性能還需要進(jìn)一步評估。如果該檢測體系能成功應(yīng)用于臨床診斷，必將大大提高(1，3)-β-D-葡聚糖檢測的特異性，降低對檢測人員技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境的要求，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、簡便、快捷診斷侵襲性真菌病。

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Preparation of polyclonal antibody and development of a com petitive ELISA for fungal(1，3)-beta-D-glucan

YAN Jun1，YANG Wei2，ZHAI Shuanzhu1，XUE Zhixin1，YU Peng1，ZHOU Zeqi1.(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Tianjin Medical Instrument Technical Evaluation Center，Tianjin 300070，China)

ObjectiveTo develop a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)with high specificity and sensitivity for fungal(1，3)-beta-D-glucan.MethodsRabbit polyclonal antibody was produced by immunization with protein-conjugated(1，3)-beta-D-glucan and fungal extract.The highest titer and little crossreactivity polyclonal antibody was labeled with horseradish peroxidase(HRP)and purified.Finally，a competitive ELISA was established for fungal(1，3)-beta-D-glucan.ResultsThe linear range was 3.125-200 pg/mL.The recovery range for 100，25 and 6.25 pg/mL serum antigen was 97.8%-113.6%，and the coefficient of variation for repeated test was＜15%.The detection system could effectively detect low concentrations ofAspergillus fumigatusandCandida albicansand high concentration ofCryptococcus neoformansfrom serum samples.Meanwhile，the detection system demonstrated little interference against 5 kinds of pathogenic bacteria，includingMycobacterium tuberculosis，Escherichia coli，Salmonella，KlebsiellaandStaphylococcus aureus.ConclusionsA competitive ELISA is developed successfully for the detection of invasive fungal disease with(1，3)-beta-D-glucan used as a coated antigen and enzymelabeled antibody HRP-Ab3B used as a detection antibody.

(1，3)-beta-D-glucan;Enzyme-linked immunosorbent assay;Invasive fungal disease

1673-8640(2015)09-0931-03

R446.61

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.015

2015-02-25)

(本文編輯:姜敏)

嚴(yán)俊，男，1987年生，碩士，主要從事臨床微生物疾病早期診斷研究。