楊林芳 曹玉萍 張孟麗 馬鵬程 李玲珺 魏峻 陶蕾 劉維達(dá)
維A酸是維生素A類衍生物,利用其抗炎作用,治療包括銀屑病在內(nèi)的多種慢性炎癥性皮膚病。本課題組合成的新型維A酸類藥物derivativeN-(4-ethoxycarbonylphenyl)isoretinamide(ECPIRM,已申請專利,專利號:201310219734.4)主要通過非受體激活途徑,在發(fā)揮其抗炎作用的同時減輕臨床不良反應(yīng)。白細(xì)胞介素1(IL-1)家族在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中扮演重要角色,在銀屑病等炎癥性皮膚病中表達(dá)量升高[1]。角質(zhì)形成細(xì)胞在調(diào)節(jié)炎癥過程中起重要作用,Th17細(xì)胞的產(chǎn)物IL-17刺激角質(zhì)形成細(xì)胞IL-1β上調(diào),加重皮膚炎癥[2]。本研究通過觀察IL-17對HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β的干預(yù)作用,探討IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響,以及ECPIRM及ATRA對IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β表達(dá)的干預(yù)作用。
一、材料
永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存),ECPIRM(本課題組合成),IL-17(美國Peprotech公司),DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物公司),MTT(美國Sigma-Aldrich公司),Trizol(美國 Life Technologies公司),SYBR green實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒(大連TaKaRa公司),人IL-1β定量ELISA試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司),全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司),GeneAmp PCR System 9700(美國 ABI公司)熒光定量PCR儀(美國ABI)。
(1)通風(fēng):是豬舍降溫放熱的有效措施,即可排除舍內(nèi)的熱量,又能改善空氣污濁度,保持舍內(nèi)空氣新鮮。實(shí)際生產(chǎn)中要依據(jù)舍內(nèi)空氣質(zhì)量和溫濕度的情況,適時通風(fēng)換氣。
二、方法
為了與原方案對比,仍采用原來的刀盤網(wǎng)格模型,用原先的單元尺寸對異形刀片重新劃分網(wǎng)格,并和刀盤網(wǎng)格模型組合后形成優(yōu)化方案3的CFD模型。設(shè)置相同的邊界條件,待流場穩(wěn)定后測得一個旋轉(zhuǎn)周期內(nèi)刀片上的扭矩,如圖14所示。
ECPIRM對HaCaT細(xì)胞的抑制生長作用具有濃度及時間依賴性(表2)。24 h時,低濃度ECPIRM(20、40 μmol/L)對HaCaT細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用,80 μmol/L ECPIRM對HaCaT細(xì)胞生長沒有影響;隨著ECPIRM濃度增高,抑制HaCaT細(xì)胞生長。48 h 時,ECPIRM(20、40 μmol/L)對 HaCaT 細(xì)胞生長沒有影響,隨著濃度升高出現(xiàn)抑制。72 h時,各濃度ECPIRM均抑制HaCaT細(xì)胞生長。以下實(shí)驗(yàn)選擇80 μmol/L ECPIRM。
寧夏十年九旱,是我國極度干旱缺水的地區(qū)之一。多年平均降水量289 mm,蒸發(fā)量1 250 mm。當(dāng)?shù)厮Y源量少質(zhì)差、時空分布不均。全區(qū)水資源總量11.63億m3,其中地表水資源量9.49億m3。經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展主要依賴于國家限量分配的黃河水,全區(qū)水資源可利用量41.5億m3,人均占有量687m3,不足全國平均值的1/3。按自然地理特點(diǎn)、經(jīng)濟(jì)狀況,全區(qū)大體分為北部引黃灌區(qū)、中部干旱帶和南部山區(qū)。
5.RT-PCR檢測IL-1β mRNA相對表達(dá)水平:采用Trizol法提取HaCaT細(xì)胞總RNA,測定純度并定量后反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IL-β 上游引物 5′-TTACAGTGGCAATGAGGATGA C-3′,下游引物 5′-GTGGTGGTCGGAGATTCGTA-3′;內(nèi)參照β肌動蛋白上游引物5′-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3′,下游引物 5′-TCACCTTCACCGT TCCAGTTT-3′,反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 10 min,變性 95℃ 15 s,退火 60 ℃ 30 s,延伸 72℃ 30 s,循環(huán)數(shù) 40。采用 2-ΔΔCt法,ΔCt= 目的基因 Ct值 - β 肌動蛋白Ct值;ΔΔCt=樣品ΔCt-對照樣品ΔCt。以對照組目的基因表達(dá)量為1,2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。
當(dāng)時,火鍋的質(zhì)地有陶瓷、純銀、銀鍍金、銅、錫、鐵數(shù)種。其基本形式有兩種:一種為組合式,由鍋、爐支架、爐圈、爐盤、酒精碗5部分組成,可以同時上桌燒煮食物,也可單獨(dú)用鍋溫食品。另一種為鍋中帶爐,爐內(nèi)燒炭火,能把水燒開,生魚、生肉、蔬菜等放入沸水中可以煮熟。
3.MTT法檢測細(xì)胞增殖活性:96孔板中各組細(xì)胞培養(yǎng)完畢后,每孔加入5 g/L MTT 20 μl,37℃避光孵育4 h后棄上清液,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩儀上低速振蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔A值。
二、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響
一、MTT法檢測不同藥物濃度對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響
ATRA對HaCaT細(xì)胞具有抑制生長的作用,并有濃度及時間依賴性(表 1),其中 1 μmol/L 及 5 μmol/LATRA作用24 h對細(xì)胞增殖沒有影響,以下實(shí)驗(yàn)選擇 5 μmol/L ATRA。
1.細(xì)胞培養(yǎng):HaCaT細(xì)胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,37℃5%CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶以后,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次,加0.25%胰蛋白酶消化液,待鏡下細(xì)胞呈圓形時加DMEM培養(yǎng)基終止消化,細(xì)胞收集于離心管中,40×g離心4 min,棄上清液,重懸于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。
表1 不同濃度全反式維A酸(ATRA)對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響(A值,±s)
表1 不同濃度全反式維A酸(ATRA)對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響(A值,±s)
注:n=5。與對照組相比,a:P < 0.05
2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率(%) A值 抑制率(%) A值 抑制率(%)對照組 0.5 4 5±0.0 0 6 - 0.8 5 5±0.0 2 0 - 1.5 1 2±0.0 2 0 -1 μ m o l/L A T R A 0.5 4 4±0.0 0 8 0.2 3 0.8 2 2±0.0 6 0 a 4.4 1 1.3 0 9±0.0 2 0 a 1 4.3 6 5 μ m o l/L A T R A 0.5 4 3±0.0 0 5 1.4 8 0.7 8 7±0.0 1 0 a 8.8 4 1.2 4 3±0.0 2 0 a 1 9.9 2 1 0 μ m o l/L A T R A 0.5 2 9±0.0 0 8 a 4.4 5 0.7 5 1±0.0 2 0 a 1 4.6 3 1.1 9 3±0.0 1 0 a 2 3.3 9 5 0 μ m o l/L A T R A 0.4 7 2±0.0 0 7 a 1 7.0 3 0.6 2 6±0.0 2 0 a 2 9.7 9 1.0 3 2±0.0 6 0 a 3 5.7 3 1 0 0 μ m o l/L A T R A 0.4 0 6±0.0 0 3 a 3 1.2 8 0.5 5 3±0.0 3 0 a 3 9.3 4 0.8 9 8±0.0 3 0 a 4 3.2 3 F值 3 9.3 5 1 9.7 1 2 0.0 4 P值 <0.0 5 <0.0 5 <0.0 5組別
表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響(A值,±s)
表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響(A值,±s)
注:n=5。與對照組相比,a:P < 0.05
2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率(%) A值 抑制率(%) A值 抑制率(%)對照組 0.5 6 9±0.0 1 4 - 0.8 1 7±0.0 2 0 - 1.3 1 2±0.0 1 0 -2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 2±0.0 0 3 a -3.1 0 0.8 2 0±0.0 2 0 0.3 3 1.1 8 8±0.0 3 0 a 1 0.1 8 4 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 4±0.0 0 3 a -3.9 1 0.8 1 8±0.0 2 0 0.0 6 0.9 2 9±0.0 2 0 a 3 1.2 9 8 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 6 8±0.0 0 9 0.4 6 0.7 6 3±0.0 3 0 7.4 1 0.6 6 1±0.0 3 0 a 5 3.1 4 1 6 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 2 3±0.0 0 2 a 9.6 1 0.4 4 1±0.0 2 0 a 5 1.5 4 0.3 0 2±0.0 3 0 a 8 2.5 4 3 2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.3 6 1±0.0 0 9 a 4 3.3 5 0.1 5 1±0.0 2 0 a 9 1.2 7 0.1 8 3±0.0 1 0 a 9 3.2 3 F值 5 7.1 4 7 4.6 7 7 7.3 6 P值 <0.0 5 <0.0 5 <0.0 5組別
2.實(shí)驗(yàn)分組:MTT實(shí)驗(yàn)分為ECPIRM組、ATRA組、IL-17組、ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組。不同濃度 ECPIRM 組(20、40、80、160、320μmol/L)及 ATRA 組(1、5、10、50、100 μmol/L)分別作用 24、48 及 72h,IL-17(20μg/L)組作用 24h,IL-17(20μg/L)+ECPIRM(80 μmol/L)組作用 24 h,IL-17(20 μg/L)+ATRA(5 μmol/L)組作用 24 h,同時設(shè)對照組(加等量的IL-17溶解液)。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
80μmol/L ECPIRM及5μmol/LATRA與20μg/L IL-17作用于HaCaT細(xì)胞后,對照組、IL-17組、ATAR+IL-17組、ECPIRM+IL-17組細(xì)胞增殖活力(A值)分別為1.312±0.011、1.316±0.014、1.297±0.024、1.230 ± 0.014,經(jīng)單因素方差分析,F(xiàn)=1.702,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
4.IL-1β的含量測定:離心收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用IL-1β ELISA試劑盒檢測,按照說明書步驟操作,實(shí)驗(yàn)完成后用酶標(biāo)儀測定A值,根據(jù)測定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各組樣品中IL-1β含量。
是的,是有過。因?yàn)槲液湍信笥岩淮纬臣?,他失手推倒我,孩子沒出生就夭折。那個時候我脾氣暴戾,我們?yōu)榱诵∈戮涂梢源蟠虺鍪?,過后又會互相乞求對方原諒,糾纏著愛著生活著,并想著永遠(yuǎn)。男朋友在我們相處的第三個年頭得了脊柱結(jié)核,動完手術(shù)之后癱瘓?jiān)诖?,醫(yī)生說他有可能這輩子都站不起來,我照顧了他兩年,有好轉(zhuǎn)的跡象,腿已經(jīng)能活動,就在我們歡歡喜喜準(zhǔn)備出院的前一天,他用水果刀刺穿了自己的心臟。是因?yàn)橐呀?jīng)能夠活動的腿突然又喪失了知覺。他再也忍受不了這樣的屈辱,所以,拋棄了親人,放棄了愛人。
見表3。與對照組比較,IL-17可上調(diào)HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β蛋白的水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組 IL-1β蛋白的表達(dá)下降,與IL-17組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組與ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
幾何教學(xué)的目的在于系統(tǒng)地研究平面上和空間物體圖形的性質(zhì),并利用這些性質(zhì)去解決計(jì)算題和作圖題;在于發(fā)展學(xué)生的邏輯的思維和對于空間的想象力,并使他們能運(yùn)用所學(xué)到的知識去解決實(shí)際問題:在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行測量,測定各種建筑物的面積和容積,作應(yīng)用于軍事方面的簡單測量等等.
表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)的影響(±s)
表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)的影響(±s)
注:n=3。ECPIRM:新型維A酸;ATRA:全反式維A酸;IL-17:白細(xì)胞介素17。a:與IL-17組相比,P<0.05;b:與對照組相比,P<0.05;c:與ECPIRM及ATRA干預(yù)組相比,P<0.05
組別I L-1 β(n g/L)I L-1 β m R N A(2-△△Ct)對照組 1 1.4 2 7±0.9 2 9 a 1.0 0±0.0 3 a I L-1 7組 2 0.3 1 2±2.0 5 3 bc 4.0 5±0.4 7 bc E C P I R M+I L-1 7組 1 2.4 7 0±1.8 9 7 a 0.8 2±0.1 2 a A T R A+I L-1 7組 1 2.6 9 4±1.4 7 8 a 0.8 7±0.1 8 a F值 2 4.6 8 2 1.0 1 P值 <0.0 5 <0.0 5
三、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響
見表3。IL-17組與對照組比較,HaCaT細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17 組 IL-1β mRNA表達(dá)下降,與IL-17組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組、ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚炎癥性疾病如銀屑病發(fā)病過程中重要的一環(huán),它可通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和化學(xué)因子而發(fā)揮作用。IL-1β在皮膚炎癥性疾病的致病中發(fā)揮重要作用[3],包括銀屑病、特應(yīng)性皮炎[4-5]等。有報道將IL-1β拮抗劑gevokizumab應(yīng)用于泛發(fā)型膿皰性銀屑病取得較好療效[6]。Th17細(xì)胞與銀屑病、特應(yīng)性皮炎等慢性皮膚炎癥性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[7],IL-17是Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,參與銀屑病的致病過程并參與角質(zhì)形成細(xì)胞的多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,它可以通過上調(diào)促炎介質(zhì)、中性粒細(xì)胞趨化因子和炎癥趨化因子,活化T細(xì)胞跨越胞外域參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[8]。
維A酸通過調(diào)節(jié)天然免疫和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能,抑制各種炎癥因子釋放,參與機(jī)體的炎癥活動[9]。有報道全反式維A酸ATRA在炎癥發(fā)生時對穩(wěn)定人類天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞起到關(guān)鍵作用,通過抑制人類天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞向Th1和(或)Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化,抑制IL-1和IL-6配體功能發(fā)揮作用,成為一種控制免疫介導(dǎo)的慢性自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療方向[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,ATRA可抑制由IL-17刺激誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。維A酸通過與HaCaT細(xì)胞表面的維A酸受體(RAR、RXR)結(jié)合引發(fā)系列生物學(xué)效應(yīng)[11],ATRA 通過激活RAR抑制炎癥環(huán)境中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌[12]。另有實(shí)驗(yàn)報道,9-cis-RA通過與RXR結(jié)合抑制由高糖引起的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)及血管細(xì)胞間黏附分子1(VCAM-1)的產(chǎn)生[13]。另一方面維A酸受體的表達(dá)及激活與臨床不良反應(yīng)相關(guān),為了減少不良反應(yīng)的發(fā)生,我們嘗試應(yīng)用非受體激活的新型維A酸衍生物來探究其影響及作用機(jī)制。ECIRM是以13-cis-RA為原料合成,前期研究表明,其作用過程中對RAR和RXR均無明顯的激活作用[14]。提示除了受體依賴途徑外,維A酸尚能通過非受體依賴途徑抑制炎癥因子的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎作用。本研究中,根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們選擇對HaCaT細(xì)胞生長無影響的ECPIRM及ATRA藥物濃度。結(jié)果提示,IL-17可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β,ECPIRM及ATRA均可以抑制由IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。上述結(jié)果可為多種慢性炎癥性皮膚病提供新的治療思路和理論依據(jù),但更深入詳盡的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
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